Constructing a synthetic constitutive metabolic pathway in Escherichia coli for (R, R)-2,3-butanediol production
- 作者
- Ying-Jia Tong, Xiao-Jun Ji, Meng-Qiu Shen, Lu-Gang Liu, Zhi-Kui Nie, He Huang
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-7013-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
天然微生物生产(R,R)-2,3-丁二醇时产物对映体纯度低，且多为条件致病菌，不适合工业放大；需要开发非致病、工业友好且能高光学纯度生产(R,R)-2,3-丁二醇的宿主菌。
研究策略
以大肠杆菌MG1655为宿主，利用不含lac序列的pUC6S载体构建人工合成组成型多顺反子代谢通路；比较强启动子P01和弱启动子PBB对基因簇表达及产量的影响，并进一步在ydjL基因前添加强启动子P01以强化乙偶姻向(R,R)-2,3-丁二醇转化，最后通过正交实验优化发酵条件。
核心内容
该研究以大肠杆菌MG1655为宿主，构建人工合成组成型多顺反子代谢通路用于生产高光学纯度的(R,R)-2,3-丁二醇。作者选用不含lac序列的pUC6S载体以避免乳糖操纵子干扰组成型表达，并系统比较了强启动子P01和弱启动子PBB对budB、budA和ydjL基因簇表达及产物合成的影响。结果显示P01强度约为PBB的两倍，强启动子菌株YJ2摇瓶发酵产生30.87 g/L(R,R)-2,3-丁二醇和7.95 g/L乙偶姻，显著优于弱启动子菌株YJ1的14.70 g/L和14.43 g/L，且YJ2乙酸产量为零。进一步在ydjL基因前添加强启动子P01获得菌株YJ3，其乙偶姻较YJ2降低20%，(R,R)-2,3-丁二醇产量在41小时达31.5 g/L。经3-L发酵罐正交优化（pH 6.5、400 rpm、1.5 vvm），80 g/L葡萄糖在18小时内产出30.5 g/L(R,R)-2,3-丁二醇和3.2 g/L乙偶姻，对映体纯度超过99%，产率0.4 g/g，生产力1.7 g/(L·h)。该策略证明了启动子强度优化和关键基因强化对提高产物纯度与产量的有效性，为工业规模生产高光学纯度(R,R)-2,3-丁二醇提供了非致病宿主平台。
创新点
['选用不含lac序列的pUC6S载体，消除乳糖操纵子对组成型表达的干扰', '系统比较强/弱组成型启动子对(R,R)-2,3-丁二醇合成的影响，证明强启动子更有利', '在多顺反子载体后置基因ydjL前额外添加强启动子P01，有效降低乙偶姻积累并提高产物产量']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | (R,R)-2,3-丁二醇合成途径 | budB | α-乙酰乳酸合酶（ALS） | 催化 | 源自肺炎克雷伯氏菌CICC 10011，催化丙酮酸生成α-乙酰乳酸 |
| Escherichia coli MG1655 | (R,R)-2,3-丁二醇合成途径 | budA | 乙酰乳酸脱羧酶（ALDC） | 催化 | 源自肺炎克雷伯氏菌CICC 10011，催化α-乙酰乳酸生成乙偶姻 |
| Escherichia coli MG1655 | (R,R)-2,3-丁二醇合成途径 | ydjL | (R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶（2,3-BDH） | 催化 | 源自枯草芽孢杆菌168，催化乙偶姻可逆转化为(R,R)-2,3-丁二醇 |
| Escherichia coli MG1655 | (R,R)-2,3-丁二醇合成途径 | AlperPLTet01 (P01) / AlperBB (PBB) | — | 调控 | 来自Alper启动子库的组成型启动子，P01强度为PBB的2倍 |
关键发现
- P01启动子强度为PBB的2倍
- 摇瓶发酵中，强启动子菌株E. coli YJ2产生30.87 g/L (R,R)-2,3-丁二醇、7.95 g/L乙偶姻，而弱启动子菌株YJ1仅14.70 g/L (R,R)-2,3-丁二醇、14.43 g/L乙偶姻
- YJ2乙酸产量为0，而野生型MG1655乙酸达5.15 g/L
- 通过额外添加P01强化ydjL表达得到菌株YJ3，其乙偶姻较YJ2降低20%，(R,R)-2,3-丁二醇产量在41h时为31.5 g/L（YJ2为30.9 g/L）
- 经3-L发酵罐正交优化后（pH 6.5、400 rpm、1.5 vvm），80 g/L葡萄糖18h内产30.5 g/L (R,R)-2,3-丁二醇和3.2 g/L乙偶姻，对映体纯度>99%，产率0.4 g/g，生产力1.7 g/(L·h)。
研究结论
通过优化组成型启动子强度并强化ydjL基因表达，成功构建了高效生产高对映体纯度(R,R)-2,3-丁二醇的重组大肠杆菌菌株YJ3，该策略可推广至其他类似工业生物过程。