Selective oxidation of carotenoid-derived aroma compounds by CYP260B1 and CYP267B1 from Sorangium cellulosum So ce56
- 作者
- Martin Litzenburger, Rita Bernhardt
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-7269-7
- 所属领域
- 酶工程与生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
类胡萝卜素衍生的香气化合物（去甲异戊二烯，如紫罗兰酮和突厥酮）的羟基化在有机化学中缺乏区域和立体选择性，需要发现能够在温和条件下选择性氧化的生物催化剂（P450酶）。
研究策略
以粘细菌Sorangium cellulosum So ce56来源的CYP260B1和CYP267B1为对象，体外筛选14种紫罗兰酮/突厥酮类底物；进一步利用大肠杆菌全细胞体系放大反应，通过NMR鉴定产物结构。
研究路线图
核心内容
针对类胡萝卜素衍生香气化合物（紫罗兰酮和突厥酮类去甲异戊二烯）在化学氧化中缺乏区域与立体选择性的问题，该研究系统评价了粘细菌来源的CYP260B1和CYP267B1两种P450酶的催化潜力。以大肠杆菌全细胞体系表达功能酶并辅以体外筛选，对14种底物进行转化，通过NMR鉴定产物结构。结果显示两种酶均能转化全部底物，多数转化率达80–95%，但damascones等仅50–75%。CYP267B1表现出优异的烯丙位羟化区域选择性和非对映选择性，对多数底物单一产物占比超过90%，且所有烯丙醇产物均为3,6-trans构型；CYP260B1则兼具烯丙位羟化与环氧化活性，如催化β-ionone主产5,6-epoxy-β-ionone（约75%）。全细胞体系产物产量为2–20 mg/L，并鉴定出3个新产物（2-OH-δ-damascone、3-OH-allyl-α-ionone、4-OH-allyl-β-ionone）。该工作首次证明这两种P450能选择性氧化类胡萝卜素衍生香气化合物，拓宽了去甲异戊二烯氧官能化的生物催化工具酶范围，为温和条件下高选择性合成香料提供了新途径。
创新点
首次证明CYP260B1和CYP267B1能够氧化类胡萝卜素衍生的香气化合物；发现CYP267B1具有高区域/非对映选择性的烯丙位羟化活性，CYP260B1对部分底物表现出环氧化活性；鉴定出3个新产物（2-OH-δ-damascone、3-OH-allyl-α-ionone、4-OH-allyl-β-ionone）。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) gold | 类胡萝卜素衍生的去甲异戊二烯（紫罗兰酮/突厥酮）选择性氧化 | CYP260B1 | CYP260B1 | 催化 | P450单加氧酶；主要催化烯丙位羟化，对β-ionone及甲基取代α-紫罗兰酮衍生物展现环氧化活性 |
| E. coli BL21(DE3) gold | 类胡萝卜素衍生的去甲异戊二烯（紫罗兰酮/突厥酮）选择性氧化 | CYP267B1 | CYP267B1 | 催化 | P450单加氧酶；高区域/非对映选择性烯丙位羟化酶，产物均为3,6-trans构型 |
| E. coli BL21(DE3) gold | 电子传递链（P450还原系统） | Adx4-108 | 肾上腺皮质铁氧还蛋白（Adx4-108） | 能量供给 | 来自Bos taurus，截短型铁氧还蛋白，为P450提供电子 |
| E. coli BL21(DE3) gold | 电子传递链（P450还原系统） | AdR | 肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶（AdR） | 能量供给 | 来自Bos taurus，NADPH依赖的还原酶，用于体外重构系统 |
| E. coli BL21(DE3) gold | 电子传递链（P450还原系统） | fpr | 铁氧还蛋白还原酶Fpr | 能量供给 | 全细胞体系中替代AdR的电子传递伙伴（来自大肠杆菌） |
关键发现
- 两种P450均可转化全部14种底物
- CYP260B1对多数底物转化率为90–95%，CYP267B1为80–95%，但damascones（8–10）和allyl-α-ionone（14）仅50–75%。CYP267B1对多数底物高选择性生成单一产物，副产物<10%（δ-damascone约15%）
- CYP260B1对β-ionone（2）的主产物5,6-epoxy-β-ionone（15）约75%，副产物约15%。全细胞体系产物产量为2–20 mg/L。CYP267B1催化所有底物生成烯丙醇，均为3,6-trans-构型
- CYP260B1对β-damascone（9）和δ-damascone（10）生成烯丙醇，对β-ionone（2）及甲基取代α-紫罗兰酮衍生物（12、13）生成4,5-环氧化物。新产物2-OH-δ-damascone（23）、3-OH-allyl-α-ionone（31）和4-OH-allyl-β-ionone（32）经NMR鉴定。
研究结论
CYP260B1和CYP267B1是去甲异戊二烯类香气化合物的有效生物催化剂：CYP267B1具有优异的烯丙位羟化区域选择性和非对映选择性（全生成3,6-trans产物），CYP260B1则兼具烯丙位羟化和环氧化活性，拓宽了该类化合物氧官能化的工具酶范围。