Characterization and evolution of an activator-independent methanol dehydrogenase from Cupriavidus necator N-1
- 作者
- Tung-Yun Wu, Chang-Ting Chen, Jessica Tse-Jin Liu, Igor W. Bogorad, Robert Damoiseaux, James C. Liao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Los Angeles; Department of Molecular and Medicinal Pharmacology, University of California, Los Angeles
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7320-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
缺乏不依赖激活蛋白、在中温条件下具有显著甲醇催化活性的 NAD 依赖型甲醇脱氢酶，限制了合成甲基营养型微生物转化甲醇的应用。
研究策略
从非甲基营养型革兰氏阴性菌 Cupriavidus necator N-1 中克隆并表征推定甲醇脱氢酶 Mdh2，验证其不依赖激活蛋白的甲醇氧化活性；随后建立基于 Nash 反应的高通量筛选平台，通过两轮易错 PCR 和突变重组获得催化效率和底物特异性提高的变体。
核心内容
该研究从非甲基营养型革兰氏阴性中温菌Cupriavidus necator N-1中克隆并表征了推定甲醇脱氢酶Mdh2，首次报道了不依赖激活蛋白的NAD依赖型甲醇脱氢酶。野生型Mdh2在30°C、pH 9.5条件下甲醇比活为0.32 U/mg，对甲醇的Km为132.1 mM，且不受来自Bacillus methanolicus的ACT或多种Nudix蛋白的激活或抑制。在此基础上，作者建立了基于Nash反应的高通量筛选平台，将Z'因子从0.23优化至0.76，并通过两轮易错PCR和突变重组进行定向进化，获得变体CT4-1（A26V/A31V/A169V）。该变体甲醇Km降至21.6 mM，催化效率Kcat/Km从野生型的1.6提高至9.3 M⁻¹ s⁻¹，提升约6倍，同时对正丁醇的特异性降低约19倍，对乙醇和丙醇的比活力也下降5至8倍，底物特异性显著改善。CT4-1对甲醇的催化效率比谷氨酸棒杆菌AdhA高4.4倍。该工作为合成甲基营养型代谢工程提供了首个来自中温非甲基营养菌的高效甲醇氧化酶元件，拓展了甲醇生物转化途径的酶工具箱。
创新点
首次报道来自革兰氏阴性、中温、非甲基营养菌的不依赖激活蛋白的 NAD 依赖型甲醇脱氢酶 Mdh2；开发了自动化高通量筛选（Z'因子从0.23优化至0.76）；通过定向进化获得甲醇催化效率提高约6倍、对正丁醇特异性降低约19倍的变体CT4-1。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cupriavidus necator N-1 | 甲醇氧化 | mdh2 | Mdh2 | 催化 | NAD依赖型甲醇脱氢酶，不依赖激活蛋白，在30°C下甲醇比活0.32 U/mg |
| Cupriavidus necator N-1 | 甲醇氧化 | mdh1 | Mdh1 | 催化 | 在E. coli中表达纯化后无甲醇氧化活性 |
| Bacillus methanolicus PB1 | 甲醇氧化 | act | ACT | 调控 | 已知激活蛋白，对Mdh2无激活作用 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲醇氧化 | nudF | NudF | 调控 | ACT同源Nudix水解酶，对Mdh2无激活作用 |
| Cupriavidus necator N-1 | 甲醇氧化 | CNE_BB1p03180, CNE_1c08460, CNE_1c14320, CNE_1c04760, CNE_1c10080 | Nudix家族蛋白 | 调控 | 5个推定内源Nudix激活蛋白均不能激活Mdh2 |
| Escherichia coli | 甲醇氧化 | mdh2 | Mdh2变体（CT1-1, CT1-2, CT2-1, CT4-1等） | 催化 | E. coli作为表达和定向进化筛选的底盘细胞，最佳变体CT4-1甲醇Km 21.6 mM |
关键发现
- 野生型Mdh2在30°C、pH
- 5条件下甲醇比活为0.32 U/mg，甲醇Km为132.1 mM，NAD+ Km为0.93 mM；最适pH
- 5，55°C孵育10分钟仅剩13%活性，60°C失活；1 mM Ni2+激活，0.1 mM Cu2+或Zn2+抑制；对B. methanolicus ACT、E. coli NudF及C. necator中的5个Nudix蛋白均不敏感；Mdh3在60°C下被ACT激活超过15倍（比活达0.35 U/mg）。通过定向进化获得CT4-1（A26V/A31V/A169V），其甲醇Km降至21.6 mM，Kcat为0.20 s-1，Kcat/Km为9.3 M-1 s-1（较野生型1.6提高约6倍）；正丁醇Km升至120 mM，Kcat/Km降至48 M-1 s-1（较野生型903降低约19倍）；对乙醇和丙醇的比活力降低5-8倍；CT4-1比C. glutamicum AdhA的甲醇催化效率高4.4倍。
研究结论
C. necator N-1 Mdh2是首个在革兰氏阴性中温非甲基营养菌中发现的不依赖激活蛋白的NAD依赖型甲醇脱氢酶，经定向进化获得的CT4-1变体具有显著改善的甲醇催化效率和底物特异性，为合成甲基营养代谢工程提供了有潜力的酶元件。