Improving isopropanol tolerance and production of Clostridium beijerinckii DSM 6423 by random mutagenesis and genome shuffling
- 作者
- H. Máté de Gérando, F. Fayolle-Guichard, L. Rudant, S. K. Millah, F. Monot, Nicolas Lopes Ferreira, A. M. López-Contreras
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7302-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
野生型拜氏梭菌DSM 6423在异丙醇浓度达到35 g/L时生长受抑制，且该菌株缺乏公开基因组序列和遗传操作工具，难以通过定向代谢工程提高其异丙醇耐受性和IBE（异丙醇/丁醇/乙醇）发酵产量。
研究策略
采用NTG化学诱变产生突变库，利用异丙醇、溴代丁酸酯和烯丙醇等选择性压力进行筛选；对最优突变株进行多轮原生质体融合（基因组改组），每轮以提高异丙醇耐受性为筛选指标，最终获得耐受性和产量改良的菌株。
核心内容
针对缺乏遗传操作工具的拜氏梭菌DSM 6423，该研究采用NTG化学诱变结合基因组改组策略，以提升其异丙醇耐受性与IBE发酵产量。研究先通过NTG诱变构建突变库，并以异丙醇、溴代丁酸酯和烯丙醇为选择性压力筛选突变株，获得36株突变体，其中最优菌株异丙醇产量较野生型的1.54 g/L提高33%至2.06 g/L。随后对优良突变株进行多轮原生质体融合，第一轮改组菌株F1.B的丁醇产量达9.95 g/L，比野生型提高75%，总溶剂产量提升69%；经两轮改组后，菌株耐受异丙醇浓度从35 g/L提升至50 g/L，增幅达43%。总体最佳菌株的异丙醇和丁醇产量分别较野生型提高23%和21%。研究表明，基因组改组能有效突破该菌的耐受瓶颈并改善产量，但耐受性提升并不总是伴随产物合成增加，第二轮改组未进一步增产。该方法为缺乏遗传工具的梭菌菌株性能改良提供了可行途径。
创新点
首次将随机诱变与基因组改组联合应用于天然IBE生产菌C. beijerinckii DSM 6423；利用自杀底物溴代丁酸酯和烯丙醇筛选特定代谢表型突变株；证明基因组改组可有效提高该菌的异丙醇耐受性（最高50 g/L），并获得了异丙醇和丁醇产量显著提高的第一轮改组菌株。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium beijerinckii DSM 6423 (NRRL B593) | 异丙醇/丁醇/乙醇（IBE）发酵 | — | — | — | 底盘菌株，天然IBE生产菌，无公开基因组序列和成熟遗传操作工具 |
| Clostridium beijerinckii DSM 6423 | 酸再同化途径（乙酸/丁酸再吸收） | ctfAB | CoA转移酶 | 催化 | 推测突变株可能通过提高ctfAB表达增强酸再同化，促进溶剂生成 |
| Clostridium beijerinckii DSM 6423 | 丁醇合成途径 | — | 丁醛脱氢酶 | 催化 | 烯丙醇抗性突变株中该酶活性降低，导致丁醇合成缺陷 |
| Clostridium beijerinckii DSM 6423 | 异丙醇合成途径 | — | 伯/仲醇脱氢酶 | 催化 | 参与从丙酮到异丙醇的转化，可能是烯丙醇的靶点之一 |
关键发现
- 野生型C. beijerinckii DSM 6423在35 g/L异丙醇下生长受抑
- NTG诱变后获得36株突变株，其中10株异丙醇产量高于野生型，MBB 2和ISO50 2的异丙醇产量分别为1.80 g/L和2.06 g/L，较野生型(1.54 g/L)提高17%和33%
- 第一轮基因组改组菌株F1.B、F1.C、F1.F的异丙醇产量均为1.90 g/L，比其亲本高15%，F1.C和F1.F比野生型高22%
- F1.B的丁醇产量达9.95 g/L，比野生型高75%，总溶剂比野生型高69%
- F1.F和F1.K的异丙醇/丁醇比分别为0.36和0.42，F1.K丁醇产量比野生型低33%
- 第二轮改组菌株可耐受50 g/L异丙醇，比野生型耐受极限提高43%，其中F2.KK50比F2.KK45异丙醇产量高18%，F2.BK50比F2.BK45高36%，但F2.BF50比F2.BF45低15%
- 总体最佳菌株比野生型异丙醇产量提高23%、丁醇提高21%。
研究结论
基因组改组能够有效提高拜氏梭菌DSM 6423的异丙醇耐受性，最高耐受50 g/L异丙醇（较野生型提高43%），并可通过第一轮改组获得异丙醇和丁醇产量分别提高23%和21%的菌株；但耐受性提升并不总是伴随产量增加，第二轮改组未进一步提高产量。该方法可作为缺乏遗传工具梭菌菌株性能改良的有效手段。