RNA binding protein Pub1p regulates glycerol production and stress tolerance by controlling Gpd1p activity during winemaking
- 作者
- Helena Orozco, Ana Sepúlveda, Cecilia Picazo, Emilia Matallana, Agustín Aranda
- 单位
- Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat de València, Valencia, Spain; Departamento de Biotecnología, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, IATA-CSIC, Avda. Agustín Escardino, 7, 46980 Paterna, Spain
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7340-z
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示RNA结合蛋白Pub1p在葡萄酒发酵过程中如何通过调控Gpd1p活性来影响甘油产量和酵母胁迫耐受性，并阐明其与TOR1/Sch9营养信号通路在寿命调控中的关系。
研究策略
以工业葡萄酒酵母EC1118和单倍体菌株C9为背景，构建PUB1缺失突变体及TOR1双突变体，进行模拟葡萄汁微发酵，比较细胞内外甘油积累、应激耐受性、GPDH及烟酰胺酶活性、GPD1/GPD2/STL1/FPS1等基因的mRNA水平、Gpd1p蛋白含量与过氧化物酶体定位以及时序寿命。
核心内容
该研究以工业葡萄酒酵母EC1118和单倍体菌株C9为背景，构建PUB1基因缺失突变体，通过模拟葡萄汁微发酵系统考察了RNA结合蛋白Pub1p对甘油合成、胁迫耐受及寿命调控的影响。结果显示，pub1Δ突变体在发酵第1天胞内甘油含量较野生型提高约5倍，且整个发酵期间保持较高水平；PUB1缺失不改变GPD1/GPD2/GPP1/GPP2的mRNA丰度，却显著提升Gpd1p蛋白含量与甘油-3-磷酸脱氢酶活性，同时上调甘油转运蛋白基因STL1和FPS1的转录积累，证实Pub1p在翻译后水平调控Gpd1p蛋白丰度。突变体对乙醇、渗透压和高温胁迫的耐受性显著增强，而氧化胁迫无差异。荧光定位显示Gpd1p和Pnc1p在发酵早期即被招募至过氧化物酶体，pub1Δ中该定位出现更早且荧光更强。低氮条件下pub1Δ与tor1Δ寿命均缩短，双突变体呈中间表型，表明Pub1p与TOR1/Sch9通路存在遗传互作。该研究揭示了Pub1p作为甘油代谢翻译后调控因子的新功能，操纵PUB1有望成为改良葡萄酒甘油含量和酵母发酵性能的有效策略。
创新点
首次发现Pub1p在翻译后水平而非转录水平调控Gpd1p蛋白丰度，从而调节甘油合成；证实Gpd1p和Pnc1p在葡萄酒发酵条件下定位于过氧化物酶体，且PUB1缺失使该定位提前并增强；揭示Pub1p与TOR1/Sch9通路在寿命调控中具有遗传相互作用。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 EC1118 | 甘油合成途径 | GPD1 | Gpd1p | 催化 | 甘油-3-磷酸脱氢酶主要同工酶，催化由磷酸二羟丙酮生成甘油-3-磷酸；受Pub1p翻译后调控，蛋白水平升高导致GPDH活性增加。 |
| 酿酒酵母 EC1118 | 甘油合成途径 | GPD2 | Gpd2p | 催化 | 甘油-3-磷酸脱氢酶同工酶，在发酵中表达较低且恒定，非主要调控靶点。 |
| 酿酒酵母 EC1118 | 甘油合成途径 | GPP1/GPP2 | Gpp1p/Gpp2p | 催化 | 甘油-3-磷酸磷酸酶，催化甘油-3-磷酸去磷酸化生成甘油；mRNA水平在pub1Δ中无差异。 |
| 酿酒酵母 EC1118 | 甘油转运 | STL1 | Stl1p | 转运 | 甘油/H+同向转运体，介导甘油摄取；pub1Δ中mRNA积累增加。 |
| 酿酒酵母 EC1118 | 甘油转运 | FPS1 | Fps1p | 转运 | 水甘油通道蛋白，介导甘油外排；pub1Δ中mRNA水平较高且维持时间长。 |
| 酿酒酵母 EC1118 | 转录后调控 | PUB1 | Pub1p | 调控 | RNA结合蛋白，通过抑制Gpd1p翻译影响甘油合成，并参与应激颗粒形成和寿命调控。 |
| 酿酒酵母 EC1118 | NAD+代谢/寿命调控 | PNC1 | Pnc1p | 催化 | 烟酰胺酶，催化烟酰胺转化为烟酸，解除Sir2p反馈抑制；在pub1Δ中活性升高，并定位于过氧化物酶体。 |
| 酿酒酵母 C9 | TOR1/Sch9信号通路 | TOR1 | Tor1p | 调控 | TORC1亚基，营养感知通路核心激酶；低氮条件下缺失会缩短寿命，与pub1Δ双突变体呈中间表型。 |
| 酿酒酵母 EC1118 | 过氧化物酶体生物发生 | PEX12 | Pex12p | 区室化 | 过氧化物酶体膜蛋白，参与过氧化物酶体形成；其缺失导致Gpd1p-GFP不形成点状结构，证明过氧化物酶体定位。 |
关键发现
- pub1Δ突变体在第1天细胞内甘油含量比野生型高5倍，且整个发酵期间均维持较高水平
- PUB1缺失不改变GPD1/GPD2/GPP1/GPP2 mRNA水平，但显著提高Gpd1p蛋白量和GPDH酶活性
- 同时上调甘油转运蛋白基因STL1和FPS1的mRNA积累
- 突变体对乙醇、渗透压和高温胁迫的耐受性显著提高（氧化胁迫无显著差异）
- Gpd1p和Pnc1p在发酵早期即被招募至过氧化物酶体，pub1Δ中荧光强度更强且形成更早
- 低氮条件下pub1Δ寿命缩短，tor1Δ也缩短，双突变体呈中间表型，表明Pub1p和Tor1p在同一通路中发挥作用。
研究结论
Pub1p通过翻译后机制控制Gpd1p蛋白水平进而调节甘油合成和胁迫耐受，并与TOR1/Sch9信号通路在寿命调控中相互关联；操纵PUB1可作为改善葡萄酒甘油含量和酵母发酵性能的有效策略。