A fusion protein consisting of the exopeptidases PepN and PepX—production, characterization, and application
- 作者
- Timo Stressler, Nina Pfahler, Michael Merz, Larissa Hubschneider, Sabine Lutz-Wahl, Wolfgang Claafen, Lutz Fischer
- 单位
- University of Hohenheim, Institute of Food Science and Biotechnology, Department of Biotechnology and Enzyme Science
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7478-8
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
将来源于Lactobacillus helveticus ATCC 12046的两种外肽酶PepN和PepX构建成融合蛋白，以在一个分子中结合其协同水解活性，提高分子量以利于酶膜反应器应用，并改善酶的生化特性。
研究策略
采用重叠延伸PCR通过十氨基酸linker L1连接pepN和pepX基因构建融合基因，在E. coli BL21(DE3)中IPTG诱导表达，经Ni-NTA亲和纯化后表征，并应用于酪蛋白水解及抗氧化活性测定。
研究路线图
核心内容
该研究首次构建了由瑞士乳杆菌来源的PepN和PepX外肽酶组成的融合蛋白FUS-PepN-PepX，旨在将两种协同水解活性整合到一个分子中，以提高分子量并改善酶的生化特性，从而适用于连续酶膜反应器。通过重叠延伸PCR以十氨基酸linker连接两基因，在E. coli BL21(DE3)中IPTG诱导表达并经Ni-NTA纯化获得目标蛋白。结果显示，融合蛋白同时保留两种酶活性，且特性优于单酶：FUS-PepN最适温度从30°C升至35°C，50°C孵育14天后FUS-PepX残余活性从40%提高至50%；10 mM β-巯基乙醇下FUS-PepN残余活性为104%，而单酶仅39%；K_M值分别降至0.34 mM和0.27 mM。在酪蛋白水解中，融合蛋白使相对水解度提高130%，与游离酶组合相当，水解产物的ABTS IC50为5.81 μg/mL，显示出强抗氧化能力。该融合蛋白兼具双酶活性与增强的稳定性及底物亲和力，具备在食品蛋白连续水解工艺中的应用潜力。
创新点
首次构建由外肽酶PepN和PepX组成的融合蛋白；融合蛋白同时具有两种酶活性；与单酶相比，融合蛋白的FUS-PepN最适温度从30°C提高到35°C，FUS-PepX在50°C下的残余活性从40%提高到50%，β-巯基乙醇不再抑制FUS-PepN，K_M值降低；融合蛋白的协同水解性能不降低，且水解产物具有强抗氧化能力（ABTS IC50=5.81 μg/mL）。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白水解系统 | pepN-L1-pepX | FUS-PepN-PepX | 催化 | 由PepN和PepX经L1 linker融合，兼具两种外肽酶活性 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白水解系统 | pepN | PepN | 催化 | 通用氨肽酶N，EC 3.4.11.2，来源于Lactobacillus helveticus ATCC 12046 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白水解系统 | pepX | PepX | 催化 | 脯氨酸特异性X-脯氨酰二肽氨基肽酶，EC 3.4.14.11，来源于Lactobacillus helveticus ATCC 12046 |
关键发现
- 成功构建融合蛋白FUS-PepN-PepX（理论分子量188.3 kDa，SDS-PAGE约190 kDa），在E. coli BL21(DE3)中可溶/不溶比例约1:1。生物反应器培养最高体积酶活达248 μkat/L（FUS-PepN）和228 μkat/L（FUS-PepX），最高比活分别为74 nkat/mg和83 nkat/mg；纯化后比活为280 nkat/mg和600 nkat/mg。融合蛋白的FUS-PepN最适温度35°C（单酶30°C），FUS-PepX最适温度50°C；50°C孵育14天后FUS-PepX残余活性50%（单酶40%），FUS-PepN残余50%；10 mM β-巯基乙醇下FUS-PepN残余活性104%（单酶39%）。K_M值：FUS-PepN
- 34 mM，FUS-PepX
- 27 mM（单酶分别为0.43和1.3 mM）。在酪蛋白水解中，融合蛋白使相对水解度提高130%（与单酶组合132%相当）；最终水解物ABTS IC50为5.81 μg/mL。FUS-PepN对NaCl敏感，2.5 M时残余0.5%；FUS-PepX在2.5 M时残余75%。
研究结论
融合蛋白FUS-PepN-PepX同时具有PepN和PepX活性，且生化特性在应用上优于单酶（更宽pH、更高温度稳定性、对变性试剂耐受性增强、K_M降低）。其协同水解性能与游离酶组合相当，水解物具有高抗氧化能力，因此该融合蛋白具有在连续酶膜反应器中进行食品蛋白水解的应用潜力。