高级醇 · 代谢工程文献库

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Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae

作者
Jianzhi Zhao, Xiaoming Bao, Chen Li, Yu Shen, Jin Hou
单位
State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China
杂志
Applied Microbiology and Biotechnology（2016）
DOI
10.1007/s00253-016-7375-1
所属领域
代谢工程
关键词
GeraniolGeraniol synthaseGeranyl pyrophosphateMonoterpeneSaccharomyces cerevisiae
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解决的核心问题

在酿酒酵母中单萜产量远低于倍半萜，缺乏有效的香叶基二磷酸（GPP）供给，导致香叶醇产量低

研究策略

筛选高效香叶醇合酶，比较异源GPPS和内源ERG20突变体调控GPP合成，强化甲羟戊酸途径，利用融合蛋白实现底物通道化

研究路线图

100%
核心问题：GPP供给不足，单萜产量低
策略：筛选高效香叶醇合酶tVoGES
策略：调控GPP合成（GPPS vs ERG20突变体）
关键改造：ERG20WW更优&融合蛋白底物通道化
强化MVA途径：IDI1、tHMG1、UPC2-1
结果：tVoGES+ERG20WW融合，产量66.2 mg/L
结果：补料分批发酵293 mg/L（当时最高）
结论：单萜平台建立；毒性是主要瓶颈
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核心内容

本研究针对酿酒酵母中单萜香叶醇产量远低于倍半萜的问题，系统探究了香叶基二磷酸（GPP）供给不足这一核心瓶颈。首先筛选出缬草来源的截短型香叶醇合酶tVoGES，表达后产量达2.7 mg/L，较此前报道提高4.2倍。随后比较了异源GPP合酶与内源ERG20突变体对GPP供给的调控效果，发现异源GPPS未能提升产量，而ERG20G和ERG20WW突变体分别将产量提高2.1倍和3.5倍，表明内源突变体在GPP供给上更具优势。进一步通过过表达IDI1和tHMG1强化甲羟戊酸途径，分别提高51%和83%，双过表达后产量达7.9 mg/L。将ERG20WW与tVoGES通过GGGS linker构建融合蛋白实现底物通道化，产量提升至66.2 mg/L。最终优化菌株YZG13-GE1在补料分批发酵中产量达到293 mg/L，为当时报道最高产量的7倍。研究还发现200 mg/L香叶醇完全抑制细胞生长，表明产物毒性是进一步增产的主要限制因素。该工作通过多维度代谢调控策略有效解决了GPP供给瓶颈，为酵母中其他单萜类化合物的生产提供了可借鉴的平台。

创新点

发现内源ERG20突变体ERG20WW比异源GPPS更有效提高GPP供给；构建Erg20p(F96W-N127W)-tVoGES融合蛋白并优化linker；获得当时最高香叶醇产量

研究对象（9）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 单萜生物合成途径 tVoGES 缬草香叶醇合酶（截短型） 催化 来源于Valeriana officinalis，去除N端质体靶向肽，在酿酒酵母中表达产量最高
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 甲羟戊酸途径 ERG20WW (ERG20F96W-N127W) Erg20p(F96W-N127W) 催化 法尼基焦磷酸合酶突变体，具有更高GPP合酶活性，提高香叶醇产量3.5倍
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 甲羟戊酸途径 ERG20G (ERG20K197G) Erg20p(K197G) 催化 法尼基焦磷酸合酶突变体，GPP合酶活性增强，香叶醇产量提高2.1倍
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 甲羟戊酸途径 ERG20 Erg20p（野生型） 催化 内源法尼基焦磷酸合酶，负责GPP和FPP合成，过表达或下调均不利于香叶醇生产
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 甲羟戊酸途径 IDI1 异戊烯基焦磷酸异构酶 Idi1p 催化 催化IPP异构化为DMAPP，过表达使香叶醇产量提高51%
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 甲羟戊酸途径 tHMG1 截短型HMG-CoA还原酶 催化 HMG-CoA还原酶是MVA途径限速酶，截短后过表达使香叶醇产量提高83%，鲨烯积累增加34.6倍
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 甲羟戊酸途径/甾醇合成 UPC2-1 Upc2p(G888D)转录因子 调控 甾醇合成全局转录因子的半显性突变体，过表达使香叶醇产量提高32%
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 单萜生物合成途径 tAgGPPS2, tPaGPPS2, tCrGPPS 冷杉/云杉/长春花GPP合酶（截短型） 催化 异源植物GPP合酶，在酿酒酵母中表达反而降低香叶醇产量
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B 单萜生物合成途径 tVoGES-GGGS-ERG20WW tVoGES-GGGS-Erg20p(F96W-N127W)融合蛋白 催化 通过GGGS连接肽融合，实现底物通道化，产量66.2 mg/L，比分开表达提高1.7倍

关键发现

  1. 表达tVoGES的菌株产量2.7 mg/L，比之前报道高4.2倍
  2. 过表达IDI1和tHMG1分别提高51%和83%，双过表达产量7.9 mg/L
  3. 异源GPPS未提高产量
  4. ERG20G和ERG20WW分别提高2.1和3.5倍
  5. ERG20WW与tVoGES融合（tVoGES-GGGS-ERG20WW）产量66.2 mg/L
  6. 最优菌株YZG13-GE1在补料分批发酵中产量293 mg/L，是之前报道最高产量的7倍
  7. 200 mg/L香叶醇完全抑制细胞生长

研究结论

通过筛选高效香叶醇合酶、调控GPP合成、强化MVA途径和构建融合蛋白，在酿酒酵母中实现了293 mg/L香叶醇产量，为其他单萜生产提供平台；香叶醇毒性是进一步提高产量的主要限制因素