Biotechnological production of limonene in microorganisms
- 作者
- Esmer Jongedijk, Katarina Cankar, Markus Buchhaupt, Jens Schrader, Harro Bouwmeester, Jules Beekwilder
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7337-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
柠檬烯目前主要作为柑橘汁工业的副产物获得，但产量和品质波动，且可能无法满足新型大宗应用（如生物材料、溶剂、燃料）的需求，因此需要开发微生物发酵生产柠檬烯的替代途径，并解决产量低和毒性等问题。
研究策略
综述微生物生产柠檬烯的策略，包括在微生物中引入植物柠檬烯合酶、构建GPP前体池（过表达MEP或甲羟戊酸途径、表达植物或微生物GPP合酶、改造FPP合酶等）、产物捕获（有机溶剂覆盖、顶空捕集、气体汽提等）以及缓解柠檬烯毒性的方法（外排泵、耐受性工程等）。
核心内容
柠檬烯是一种重要的单萜类化合物，目前主要来源于柑橘加工副产物，但产量波动且难以满足生物材料、溶剂和燃料等新兴大宗应用需求，因此微生物发酵生产被视为具有前景的替代路线。这篇综述系统梳理了在大肠杆菌、酵母和蓝细菌等微生物中合成柠檬烯的代谢工程策略，核心思路包括三个层面：引入植物来源的柠檬烯合酶并去除其转运肽（可使酵母产量提高4至8倍）；通过过表达MEP或甲羟戊酸途径、异源表达GPP合酶或改造FPP合酶来构建牻牛儿基二磷酸前体池；以及利用有机溶剂覆盖、顶空捕集和气体汽提等手段实现产物原位分离。此外，柠檬烯的细胞毒性是限制产量的主要瓶颈，研究表明柠檬烯氢过氧化物是毒性关键因子，而表达AhpCL177Q突变体的大肠杆菌在含10%（v/v）柠檬烯的培养液中仍能保持50%以上的生长速率。目前微生物合成柠檬烯的最高产量为大肠杆菌中的1.35 g/L，但距离与植物来源竞争仍需提升至少两个数量级，未来需在前体供应和菌株耐受性两方面持续攻关。
创新点
['系统比较了植物、化学和微生物生产柠檬烯的优缺点', '讨论了柠檬烯氢过氧化物在毒性中的关键作用及AhpCL177Q突变体缓解毒性的策略', '提出了通过产物捕获和溶剂耐受性改造提高柠檬烯产量的新思路']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BLR(DE3) | MEP途径及异源甲羟戊酸途径 | tGPPS, LS (Mentha spicata) | geranyl diphosphate synthase (Abies grandis), limonene synthase | 催化 | 表达植物GPP合酶和柠檬烯合酶，产量5 mg/L |
| Escherichia coli DH1 ΔacrAB | 甲羟戊酸途径 | HMGS, tHMGR, MVK, PMK, PMD, AACT, IDI, tGPPS, tLS | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、截短HMGR、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、乙酰乙酰辅酶A硫解酶、异戊烯基二磷酸异构酶、截短GPP合酶、截短柠檬烯合酶 | 催化 | 双质粒系统，产量57 mg/L |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 | Alcanivorax borkumensis efflux pump, HMGS, tHMGR, MVK, PMK, PMD, AACT, IDI, tGPPS | 外排泵蛋白、甲羟戊酸途径酶、截短GPP合酶 | 转运 | 表达外排泵，产量430 mg/L |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | HMGS, tHMGR, MVK, PMK, PMD, AACT, IDI, tGPPS/GPPS (Streptomyces sp. KO-3988) | 甲羟戊酸途径酶、截短GPP合酶或链霉菌GPP合酶 | 催化 | 最高产量1.35 g/L，使用邻苯二甲酸二异壬酯有机相 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径 | DXS, IDI, CrtE, LS (Schizonepeta tenuifolia) | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶、异戊烯基二磷酸异构酶、牻牛儿基二磷酸合酶、柠檬烯合酶 | 催化 | 光合自养生产，产量56 μg/L/天 |
| Synechococcus sp. PCC 7002 | MEP途径 | LS (Mentha spicata), ΔglgC | 柠檬烯合酶、糖原合成相关蛋白（敲除） | 催化 | 野生型背景产量4 mg/L，敲除glgC后产量变化未明确 |
| Saccharomyces cerevisiae AE9 | 甲羟戊酸途径 | ERG20 K197G, LS (Perilla frutescens 或 Citrus limon) | 法尼基焦磷酸合酶突变体（部分产生GPP）、柠檬烯合酶 | 催化 | 分别产量0.49 mg/L和0.12 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae EPY210C | 甲羟戊酸途径 | tHMGR, LS (Mentha spicata 或 Citrus limon) | 截短3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶、柠檬烯合酶 | 催化 | 产量1.48 mg/L |
关键发现
['目前最高柠檬烯产量为E. coli中达到1.35 g/L（Willrodt et al. 2014）', '去除柠檬烯合酶转运肽可使酵母中柠檬烯产量提高4至8倍', '表达Alcanivorax borkumensis外排泵使E. coli柠檬烯产量提高30%', '使用邻苯二甲酸二丁酯覆盖层可使柠檬烯对酵母的最低抑制浓度提高702倍', '连续顶空捕集比溶剂覆盖提取使酵母柠檬烯产量提高8倍', 'E. coli中通过甲羟戊酸途径工程和双相培养实现430 mg/L柠檬烯（Alonso-Gutierrez et al. 2013）', 'Dunlop等人通过过表达甲羟戊酸途径和tGPPS在E. coli DH1 ΔacrAB中达到57 mg/L柠檬烯', 'Carter等人在E. coli中表达薄荷柠檬烯合酶和Abies grandis tGPPS获得5 mg/L柠檬烯', 'Synechocystis sp. PCC 6803通过表达DXS、IDI和CrtE获得56 μg/L/天柠檬烯', 'Synechococcus sp. PCC 7002野生型背景中获得4 mg/L柠檬烯', '酵母中表达Perilla frutescens柠檬烯合酶和ERG20 K197G突变获得0.49 mg/L柠檬烯，表达Citrus limon柠檬烯合酶获得0.12 mg/L', 'Behrendorff等人在酵母EPY210C中通过表达tHMGR和薄荷柠檬烯合酶获得1.48 mg/L柠檬烯', '表达AhpCL177Q突变体的E. coli在含10% (v/v)柠檬烯培养液中仍保持50%以上最大比生长速率', '添加2%未氧化（厌氧储存）柠檬烯（v/v）对E. coli生长速率无明显抑制', '柠檬烯浓度约0.025% (v/v)完全抑制E. coli生长']
研究结论
微生物生产柠檬烯若要具有竞争力，产量至少还需要提高两个数量级。植物细胞通过区室化、修饰和胞外储存来适应高浓度柠檬烯，而微生物生产需要通过代谢工程构建GPP池、优化产物捕获和增强溶剂耐受性来提升产量。进一步研究GPP供应和毒性缓解策略有望实现柠檬烯的大宗生物基应用。