Engineering Aspergillus nidulans for heterologous ent-kaurene and gamma-terpinene production
- 作者
- Kirsi Bromann, Mervi Toivari, Kaarina Viljanen, Laura Ruohonen, Tiina Nakari-Setälä
- 单位
- VTT Technical Research Centre of Finland Ltd., 02044 VTT, Espoo, Finland; Orion Pharma, Orion Corporation, Orionintie 1, 02200 Espoo, Finland
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7517-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
探索构巢曲霉（Aspergillus nidulans）作为异源单萜和二萜生产宿主的潜力，并进一步表征PD合酶基因AN1594（pbcA）的功能。
研究策略
通过基因过表达和敲除验证AN1594编码PD合酶；在A. nidulans中异源表达Fusarium fujikuroi的ent-kaurene合酶（cps/ks）和Citrus unshiu的γ-萜品烯合酶（gTerpS），并利用SPME-GC/MS检测产物。
核心内容
本研究以构巢曲霉（Aspergillus nidulans）为宿主，系统评估其作为异源单萜与二萜生产平台的潜力，并深入表征了PD合酶基因AN1594（pbcA）的功能。通过基因过表达与敲除实验证实，AN1594是合成ent-pimara-8(14),15-diene（PD）所必需且充分的基因；仅过表达AN1594即可产生PD，且其表达上调12.6倍。异源表达藤仓镰孢菌的ent-kaurene合酶（cps/ks）实现了ent-kaurene生产，质谱匹配度达99%；在此基础上共过表达簇特异性转录因子PbcR，使ent-kaurene峰面积从27,881提升至62,975，提高约2.4倍。同时，通过异源表达密码子优化的柑橘γ-萜品烯合酶（gTerpS），首次在构巢曲霉中实现了单萜γ-萜品烯的生产。此外，过表达pbcR的菌株在366 nm紫外光下产生荧光，提示PD基因簇激活伴随杂环化合物生成。上述结果表明构巢曲霉具备生产工业相关萜类化合物的能力，所建立的遗传操作策略可推广至其他曲霉属工业菌株。
创新点
['首次在A. nidulans中实现异源ent-kaurene和gamma-terpinene的生产', '证实AN1594是PD合酶（PbcA）的必要且充分基因', '发现pbcR过表达菌株在UV下产生荧光，可能与PD基因簇激活产生的杂环化合物有关']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus nidulans A772 | 二萜生物合成（ent-pimara-8(14),15-diene生物合成） | AN1594 (pbcA) | PbcA (ent-pimara-8(14),15-diene合酶) | 催化 | 过表达该基因产生PD，敲除后PD消失，证实其编码PD特异性合酶 |
| Aspergillus nidulans A772 | 二萜生物合成（ent-kaurene生物合成） | cps/ks | Cps/Ks (ent-kaurene合酶) | 催化 | 来自Fusarium fujikuroi，异源表达产生ent-kaurene，质谱匹配度99% |
| Aspergillus nidulans A772 | 单萜生物合成 | gTerpS (CitMTSL61) | γ-萜品烯合酶 | 催化 | 来自Citrus unshiu，密码子优化并去除N端转运肽，异源表达产生gamma-terpinene |
| Aspergillus nidulans A772 | 二萜生物合成调控（PD基因簇） | pbcR (AN1599) | PbcR (簇特异性转录因子) | 调控 | 过表达pbcR激活PD基因簇，上调pbcA、GGPPS、CYP等基因表达 |
| Aspergillus nidulans A772 | 甲羟戊酸途径/二萜前体供给 | AN1592 (GGPPS) | GGPPS (牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶) | 催化 | PD基因簇中的GGPP合酶，负责合成二萜前体GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae H2802 | 单萜生物合成 | gTerpS (CitMTSL61) | γ-萜品烯合酶 | 催化 | 用于验证gTerpS酶活性，以GPP为底物产生gamma-terpinene |
关键发现
- ['在A772 oe:PbcR菌株中，pbcR、AN1594（pbcA）、GGPPS（AN1592）和CYP（AN1598）表达分别上调5.5倍、11.7倍、14.2倍和12倍，并产生PD（保留时间11.95 min）。', '在AN1594缺失菌株（A1149 oe:PbcR
- AN1594）中，PD产生被完全消除，而pbcR表达上调6.8倍、GGPPS 11倍、CYP 8.5倍。', '仅过表达AN1594（A772 oe:AN1594）即可产生PD，AN1594表达上调12.6倍。', '异源表达F. fujikuroi cps/ks的A772菌株产生ent-kaurene，质谱匹配度99%。', '在A772 oe:PbcR
- oe:Cps/Ks菌株中，ent-kaurene峰面积为62,975，是单独表达cps/ks菌株（峰面积27,881）的2.4倍。', '异源表达密码子优化的C. unshiu gTerpS的A772菌株（A772 oe:gTerpS）产生gamma-terpinene，保留时间5.014 min，质谱匹配度99%，首次在A. nidulans中实现异源单萜生产。', '在A772 oe:PbcR菌株中检测到多种分子量270的杂环化合物，且菌株在366 nm UV下产生荧光。']
研究结论
构巢曲霉（A. nidulans）具有异源生产二萜（ent-kaurene）和单萜（gamma-terpinene）的能力，可作为工业相关萜类化合物的生产宿主；相关遗传操作方法可推广至其他曲霉属工业菌株。