Characterization of Clostridium ljungdahlii OTA1: a non-autotrophic hyper ethanol-producing strain
- 作者
- Jason M. Whitham, Mark J. Schulte, Benjamin G. Bobay, Jose M. Bruno-Barcena, Mari S. Chinn, Michael C. Flickinger, Joel J. Pawlak, Amy M. Grunden
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7978-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析C. ljungdahlii自发突变株OTA1高产乙醇但丧失自养生长的遗传与代谢机制
研究策略
结合全基因组/转录组测序、同源建模、发酵表型分析和通量平衡模拟，鉴定影响乙醇产量的关键SNP并验证其功能
核心内容
本研究对产乙醇乙酸菌Clostridium ljungdahlii自发突变株OTA1进行了系统的遗传与代谢表征。通过全基因组和转录组测序，在OTA1中鉴定到4个特有SNP，其中关键突变为CODH/ACS复合物催化亚基AcsA的R528L替换。该突变导致Wood-Ljungdahl通路失活，使OTA1丧失在合成气上的自养生长能力。发酵表型分析显示，混养条件下OTA1乙醇产量达0.24 g/g，为野生型的4倍，乙酸产量则降至野生型的一半；异养条件下乙醇产量为0.35 g/g，亦显著高于野生型的0.18 g/g。通量平衡分析预测AcsA失活可将代谢流导向乙醇生成，其异养乙醇通量达3.35 mmol/gDW/h。此外，OTA1生物膜在24小时内消耗93.8%的CO，快于野生型。精氨酸补充可使OTA1乙醇产量再提高33%。该研究首次揭示了非自养型高产乙醇突变株的遗传基础，证明AcsA通量限制是驱动代谢流重分配、提高乙醇/乙酸比的核心因素，为理解acetogen代谢调控及工业乙醇生产、生物电催化应用提供了优良菌株和理论依据。
创新点
首次表征了非自养型高产乙醇的C. ljungdahlii自发突变株；揭示了AcsA突变导致Wood-Ljungdahl通路失活并提高乙醇/乙酸比；通过通量平衡分析预测了AcsA通量限制对乙醇通量的影响；证明OTA1在生物电催化和工业应用中的潜在价值
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium ljungdahlii OTA1 | Wood-Ljungdahl通路（乙酰-CoA合成） | CLJU_c37670 (acsA) | CODH/ACS复合物催化亚基AcsA | 催化 | R528L突变导致CO/CO2结合能力丧失或降低，使通路失活，不能自养生长，但提高乙醇产量 |
| Clostridium ljungdahlii OTA1 | 四吡咯生物合成（辅因子钴胺素合成） | CLJU_c04490 (hemL) | 谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶HemL | 催化 | G268V突变影响活性位点附近结构，降低通路活性，但对乙醇产量无直接影响 |
| Clostridium ljungdahlii OTA1 | 精氨酸分解代谢（ADI途径） | CLJU_c09320 | TrmB样ADI转录调控因子 | 调控 | 无义突变导致截短，失去调控域，引起精氨酸分解基因上调表达 |
| Clostridium ljungdahlii OTA1 | 2-脱氧-D-核糖分解代谢 | CLJU_c18110 | DeoR家族转录调控因子 | 调控 | 截短突变失去糖结合域，导致脱氧核糖分解基因上调表达 |
| Clostridium ljungdahlii OTA1 | 精氨酸分解代谢（ADI途径） | CLJU_c09270 (arcA) | 精氨酸脱亚胺酶ArcA | 催化 | 在OTA1中显著高表达（log2 fold change -8.91） |
| Clostridium ljungdahlii OTA1 | 2-脱氧-D-核糖分解代谢 | CLJU_c18130 | 脱氧核糖磷酸醛缩酶 | 催化 | 在OTA1中显著高表达（log2 fold change -7.54） |
| Clostridium ljungdahlii OTA1 | 能量代谢/氢代谢 | CLJU_c28660-70, CLJU_c14700, CLJU_c14720 | [NiFe]-氢化酶HyaBA, [FeFe]-氢化酶HydA/C | 能量供给 | 在OTA1中36h下调，可能与还原力分配有关 |
| Clostridium ljungdahlii OTA1 | 精氨酸分解代谢（ADI途径） | CLJU_c09290 | 精氨酸/鸟氨酸反向转运蛋白 | 转运 | 在OTA1中显著高表达（log2 fold change -8.00） |
关键发现
- OTA1在混养培养基中乙醇产量为0.24 g/g，是WT（0.06 g/g）的4倍（摘要表述为2倍以上）；乙酸产量为0.50 g/g，约为WT（0.83 g/g）的一半；异养条件下乙醇产量0.35 g/g vs WT
- 18 g/g，乙酸0.37 vs
- 79 g/g，CO2
- 38 vs
- 25 g/g，生物量0.12 vs
- 19 g/g。OTA1不能在仅含合成气的培养基上自养生长。OTA1生物膜在24 h内消耗了93.8%的CO，快于WT的81.4%。在OTA1基因组中鉴定到4个特有SNP：AcsA (R528L)、HemL (G268V)、ADI转录调控因子（截短）、DeoR转录调控因子（截短）。RNA-seq显示精氨酸分解和脱氧核糖分解基因在OTA1中显著高表达。通量平衡分析预测AcsA敲除导致乙醇通量3.35 mmol/gDW/h（异养）和3.33 mmol/gDW/h（混养），而WT乙酸通量4.93-5.12 mmol/gDW/h。精氨酸补充使OTA1乙醇产量提高33%。
研究结论
OTA1因AcsA突变导致Wood-Ljungdahl通路失活，无法自养生长，但通过改变代谢流和还原力分配显著提高了乙醇产量，降低了乙酸产量；ADI/DeoR转录调控因子和HemL的突变对表型影响较小。OTA1可作为研究acetogen生理、生物电催化和工业乙醇生产的优良菌株。