Engineering of the carotenoid pathway in Xanthophyllomyces dendrorhous leading to the synthesis of zeaxanthin
- 作者
- Hendrik Pollmann, Jürgen Breitenbach, Gerhard Sandmann
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2016）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7769-0
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
在 Xanthophyllomyces dendrorhous 中构建高效合成玉米黄质（zeaxanthin）的细胞工厂，解决膳食中玉米黄质供应不足的问题。
研究策略
以阻断虾青素合成并积累β-胡萝卜素的突变体 PR1-104 为底盘，通过过表达 HMGR、crtE 和 crtYB 增强类胡萝卜素前体供应和途径通量，再引入细菌 crtZ 基因（包括密码子优化）将β-胡萝卜素羟基化为玉米黄质，并通过有性生殖周期稳定转化子。
核心内容
该研究以积累β-胡萝卜素的Xanthophyllomyces dendrorhous突变体PR1-104为底盘，通过代谢工程构建玉米黄质高产菌株。策略上先阻断虾青素合成途径，再协同过表达HMGR、crtE和crtYB三个限速酶基因以增强类胡萝卜素前体供应，随后引入细菌来源的crtZ基因（β-胡萝卜素羟化酶）将β-胡萝卜素转化为玉米黄质，并通过有性生殖周期获得无选择压力下稳定的转化子。结果显示，逐步过表达三个限速酶使总类胡萝卜素从235 μg/g干重提升至800 μg/g干重。将crtZ拷贝数从1增至4并将密码子优化后，玉米黄质产量达到517 μg/g干重，占总类胡萝卜素的68%，β-胡萝卜素转化率达80%。在2L发酵罐中，细胞密度约24 g/L时玉米黄质产量达10.8 mg/L，且稳定化转化子保持非稳定化培养80-90%的产量水平。该研究证明通过途径重定向和限速酶协同过表达，可在X. dendrorhous中实现玉米黄质的规模化生产，为膳食补充剂行业提供了可持续的来源。
创新点
1. 利用β-胡萝卜素积累突变体作为底盘，将类胡萝卜素途径重定向至玉米黄质；2. 协同过表达三个限速酶基因显著提高总类胡萝卜素产量；3. 密码子优化的 crtZ 基因大幅提高玉米黄质产量和转化率；4. 通过担孢子萌发获得无选择压力下稳定的转化子，适用于规模化发酵。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous PR1-104 | 甲羟戊酸途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 类胡萝卜素前体合成的限速酶，过表达以增强IPP/DMAPP供应 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous PR1-104 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化GGPP合成，过表达增强类胡萝卜素前体供应 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous PR1-104 | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtYB | 八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶 | 催化 | 双功能酶，催化八氢番茄红素合成和番茄红素环化，为途径限速酶，过表达可提高通量并抑制torulene分支 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous PR1-104 | 类胡萝卜素生物合成途径（β-胡萝卜素→玉米黄质） | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis或Brevundimonas sp. SD212（密码子优化），催化β-胡萝卜素3,3'-羟基化生成玉米黄质。密码子优化后显著提高产量 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous PR1-104 | 类胡萝卜素生物合成途径（虾青素合成） | asy | 虾青素合酶（astaxanthin synthase） | 催化 | 在突变体PR1-104中失活，导致底物β-胡萝卜素积累 |
关键发现
- 最高玉米黄质产量在摇瓶培养中达到约 517 μg/g 干重（PR1-104-(YB)2-HMG-E-(Zo)1），占总类胡萝卜素的 68%，β-胡萝卜素到玉米黄质的转化率为 80%。通过逐步过表达 HMGR、crtE 和 crtYB，总类胡萝卜素从突变体 PR1-104 的 235±7 μg/g dw 提高到 800±22 μg/g dw，β-胡萝卜素含量从 226±8 μg/g dw 提高到 576±8 μg/g dw。crtZ 基因拷贝数从 1 增至 4 时，玉米黄质含量从 19±10 μg/g dw 提高到 200±19 μg/g dw
- 密码子优化后进一步提高到 517±17 μg/g dw。稳定化转化子在无选择压力下总类胡萝卜素和玉米黄质含量保持非稳定化培养的 80-90%。在 2L 发酵罐中，细胞密度约 24 g/L，玉米黄质产量达 10.8 mg/L（460 μg/g dw），发酵罐中β-胡萝卜素转化率进一步提升。
研究结论
本研究成功将 X. dendrorhous 改造为稳定的玉米黄质生产菌株，摇瓶产量约 500 μg/g dw，发酵罐中达 460 μg/g dw，证明其具有规模化生产玉米黄质的潜力。