Improvement of glycerol catabolism in Bacillus licheniformis for production of poly-γ-glutamic acid
- 作者
- Yangyang Zhan, Chengjun Zhu, Bojie Sheng, Dongbo Cai, Qin Wang, Zhiyou Wen, Shouwen Chen
- 单位
- Hubei Collaborative Innovation Center for Green Transformation of Bio-Resources, College of Life Science, Hubei University; State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University; College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University; Department of Food Science and Human Nutrition, Iowa State University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-017-8459-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
地衣芽孢杆菌WX-02利用甘油作为唯一碳源的能力较弱，导致γ-聚谷氨酸（γ-PGA）产量不高，需要解析其甘油代谢途径并进行代谢工程改造以提高甘油利用效率和γ-PGA产量。
研究策略
通过基因敲除鉴定甘油分解代谢途径，确定GlpK途径为唯一功能性途径；将glpFK操纵子的天然启动子替换为组成型强启动子P43、PytzE和PbacA，增强甘油利用；并比较突变株在纯甘油和生物柴油粗甘油中的γ-PGA生产性能。
核心内容
地衣芽孢杆菌WX-02以甘油为唯一碳源时γ-聚谷氨酸（γ-PGA）产量受限，其甘油代谢途径尚不清楚。该研究通过基因敲除鉴定甘油分解途径，发现ΔglpK和ΔglpD突变株在好氧和厌氧条件下均无法利用甘油，而ΔgldA1、ΔgldA2和ΔdhaK突变株生长正常，证明GlpK途径是唯一功能性甘油分解途径，DhaK途径不活跃。随后将glpFK操纵子的天然启动子替换为组成型强启动子P43、PytzE和PbacA，获得的三株突变株甘油消耗速率分别较野生型提高30.9%、26.42%和18.8%，γ-PGA产量分别提高33.71%、23.39%和30.05%，其中WX02-P43glpFK表现最佳，γ-PGA产量达17.65 g/L（野生型13.2 g/L），甘油消耗率0.61 g/L/h。转录分析显示glpF、glpK、glpD及TCA循环相关基因表达上调，谷氨酸转运蛋白基因gltT上调1.99倍。以生物柴油粗甘油为碳源时，WX02-P43glpFK可产16.63 g/L γ-PGA，生产率0.35 g/L/h。该策略证实了强化glpFK表达可有效提升甘油利用效率，为工业利用粗甘油生产γ-PGA提供了可行方案。
创新点
首次阐明B. licheniformis WX-02中甘油分解代谢主要通过GlpK途径（需GlpK和GlpD），而DhaK途径在好氧和厌氧条件下均不活跃；通过启动子替换工程上调glpFK表达，显著提高甘油消耗速率和γ-PGA产量，并证明生物柴油副产粗甘油可作为有效碳源。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（GlpK途径） | glpK | 甘油激酶（GlpK） | 催化 | ATP依赖性甘油激酶，催化甘油转化为甘油-3-磷酸，为限速酶；敲除后无法利用甘油 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（GlpK途径） | glpD | 甘油-3-磷酸脱氢酶（GlpD） | 催化 | 催化甘油-3-磷酸氧化为磷酸二羟丙酮；敲除后无法利用甘油 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（GlpK途径） | glpF | 甘油转运蛋白（GlpF） | 转运 | 甘油摄取辅助因子，与glpK形成glpFK操纵子 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（DhaK途径） | gldA1 | 甘油脱氢酶（GldA1） | 催化 | 推测催化甘油氧化为二羟丙酮，但该途径在WX-02中不参与甘油分解；可能是D-2,3-丁二醇脱氢酶 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（DhaK途径） | gldA2 | 甘油脱氢酶（GldA2） | 催化 | 同GldA1，DhaK途径不活跃 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（DhaK途径） | dhaK | 二羟丙酮激酶（DhaK） | 催化 | ATP依赖型，DhaK途径不活跃 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（glpFK启动子） | P43 promoter | — | 调控 | 来自Bacillus subtilis 168的组成型启动子，替换天然glpFK启动子，效果最佳 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（glpFK启动子） | PytzE promoter | — | 调控 | 来自B. licheniformis WX-02的ytzE启动子 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 甘油代谢（glpFK启动子） | PbacA promoter | — | 调控 | 来自B. licheniformis DW2的bacABC操纵子启动子 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | TCA循环 | icd, citZ, citB | 异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合酶、乌头酸酶 | 催化 | 转录水平上调1.12倍、1.29倍、1.6倍，增强TCA循环通量 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 代谢调控 | ccpC, codY | 转录调控因子CcpC、CodY | 调控 | 转录水平下调，解除对TCA循环基因的抑制 |
| Bacillus licheniformis WX-02 | 谷氨酸转运 | gltT | 谷氨酸转运蛋白（GltT） | 转运 | 转录水平上调1.99倍，促进谷氨酸摄取用于γ-PGA合成 |
关键发现
基因敲除实验表明ΔglpK和ΔglpD突变株在好氧和厌氧条件下均不能利用甘油，而ΔgldA1、ΔgldA2和ΔdhaK突变株生长正常，说明GlpK途径是唯一功能性甘油分解途径。用P43、PytzE和PbacA启动子替换glpFK天然启动子后，突变株WX02-P43glpFK、WX02-PytzEglpFK和WX02-PbacAglpFK的甘油消耗分别比野生型提高30.9%、26.42%和18.8%，γ-PGA产量分别提高33.71%、23.39%和30.05%（产量分别为17.65 g/L、16.29 g/L和17.17 g/L，野生型为13.2 g/L）。其中WX02-P43glpFK表现最佳，其甘油消耗率达0.61 g/L/h，γ-PGA生产率0.37 g/L/h。以生物柴油粗甘油（65 g/L，相当于纯甘油50 g/L）为碳源时，WX02-P43glpFK可产生16.63 g/L γ-PGA，生产率0.35 g/L/h，均高于野生型（0.28 g/L/h）。转录分析显示glpF、glpK、glpD表达上调，TCA循环相关基因（icd、citZ、citB）上调1.12-1.6倍，调控基因ccpC和codY下调，谷氨酸转运蛋白基因gltT上调1.99倍。
研究结论
本研究证实B. licheniformis WX-02通过GlpK途径分解甘油，DhaK途径无功能；通过启动子替换强化glpFK表达可有效提高甘油利用和γ-PGA产量，利用生物柴油粗甘油作为碳源实现16.63 g/L γ-PGA和0.35 g/L/h生产率，为工业利用粗甘油生产γ-PGA提供了可行的代谢工程策略。