Application of directed evolution to develop ethanol tolerant Oenococcus oeni for more efficient malolactic fermentation
- 作者
- Alice L. Betteridge, Krista M. Sumby, Joanna F. Sundstrom, Paul R. Grbin, Vladimir Jiranek
- 单位
- Department of Wine and Food Science, School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide, Waite Campus, Urrbrae, South Australia, Australia; Australian Research Council Training Centre for Innovative Wine Production, Urrbrae, South Australia, Australia
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-017-8593-x
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
Oenococcus oeni在葡萄酒高乙醇浓度下苹果酸乳酸发酵（MLF）易停滞、不可靠的问题
研究策略
利用定向进化（连续培养逐步提高乙醇浓度）对O. oeni SB3进行适应性进化，筛选出乙醇耐受性提高且MLF性能改善的突变株A90，并通过qPCR分析胁迫响应基因表达差异
核心内容
针对酒酒球菌（Oenococcus oeni）在高浓度乙醇葡萄酒中苹果酸乳酸发酵（MLF）易停滞的问题，该研究采用定向进化策略，通过连续培养逐步提高乙醇浓度，历时290天对O. oeni SB3菌株进行适应性进化，筛选获得乙醇耐受性显著提升的突变株A90。A90在15%乙醇中完成L-苹果酸消耗比亲本提前69小时，发酵效率提升56%；在20%乙醇暴露48小时后，亲本存活率较A90低至少4个数量级。在含13%和15%乙醇的黑比诺葡萄酒中，A90完成MLF的时间分别为亲本的75%和40%，且A90经50代传代后仍保持稳定耐受性。qPCR分析显示，A90在20%乙醇中小热休克蛋白基因hsp18表达水平高于亲本，提示该基因与耐受性增强相关。该研究首次将定向进化应用于O. oeni非重组改良，证明该策略可有效提升菌株乙醇耐受性并改善葡萄酒MLF性能，为无需基因修饰的工业菌株选育提供了可行途径。
创新点
首次将定向进化应用于O. oeni菌株改良；获得了乙醇耐受性显著提高的菌株A90；揭示hsp18等高表达与耐受性相关
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Oenococcus oeni SB3（亲本）及进化株A90 | 苹果酸乳酸发酵 | — | — | 区室化 | 定向进化实验的底盘菌株，进化株A90由SB3经连续培养获得 |
| Oenococcus oeni | 苹果酸乳酸发酵 | — | — | 催化 | MLF将L-苹果酸转化为L-乳酸和二氧化碳 |
| Oenococcus oeni | 胁迫响应 | hsp18 | 小热休克蛋白Lo18 | 调控 | 编码小热休克蛋白Lo18，参与膜保护，A90在20%乙醇下表达显著高于SB3 |
| Oenococcus oeni | 胁迫响应 | trxA | 硫氧还蛋白 | 调控 | 参与氧化还原调节，乙醇胁迫下表达上调，A90上调幅度大于SB3 |
| Oenococcus oeni | 胁迫响应 | clpX | ClpX蛋白酶亚基 | 催化 | ATP依赖性蛋白酶，参与蛋白质量控制，A90在乙醇下表达增高 |
| Oenococcus oeni | 氮代谢 | amt | 铵转运蛋白 | 转运 | 铵转运蛋白，A90在乙醇胁迫下表达增加 |
| Oenococcus oeni | 能量代谢 | atpB | ATP合酶β亚基 | 能量供给 | F0F1-ATP合酶β亚基，乙醇处理后两菌株表达均下调 |
| Oenococcus oeni | 细胞壁合成 | ddl | D-丙氨酸连接酶 | 催化 | 参与肽聚糖合成，A90在1h乙醇暴露时表达高于SB3 |
| Oenococcus oeni | 嘧啶生物合成 | pyrB | 天冬氨酸氨甲酰转移酶 | 催化 | 嘧啶生物合成第一步，随时间表达下降 |
| Oenococcus oeni | 苹果酸乳酸发酵调控 | mleR | MleR调控蛋白 | 调控 | 苹果酸乳酸发酵转录调控因子，A90在1h乙醇暴露时表达高于SB3 |
| Oenococcus oeni | 苹果酸代谢 | mleA | 苹果酸通透酶（推测） | 转运 | 可能与苹果酸转运相关，A90在1h乙醇暴露时表达低于SB3 |
| Oenococcus oeni | 柠檬酸代谢 | citE | 柠檬酸裂解酶 | 催化 | 参与柠檬酸裂解，A90表达低于SB3 |
| Oenococcus oeni | 类胡萝卜素生物合成 | gggps | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 参与类胡萝卜素前体合成，本研究中未观察到明显上调 |
| Oenococcus oeni | 膜脂合成 | cfa | 环丙烷脂肪酸合酶 | 催化 | 将顺式异油酸转化为乳杆菌酸，A90在24h乙醇暴露时表达高于SB3 |
| Oenococcus oeni | 胁迫响应 | groES | GroES伴侣蛋白 | 调控 | 分子伴侣，乙醇胁迫下上调，A90在24h时表达低于SB3 |
| Oenococcus oeni | 胁迫响应 | clpP | ClpP蛋白酶 | 催化 | ATP依赖性蛋白酶，乙醇胁迫下表达上调 |
关键发现
- 连续培养290天，乙醇浓度从0逐步升至15% (v/v)，生长速率从0.10 h⁻¹降至0.05 h⁻¹
- 进化群体在15%乙醇中完成L-苹果酸消耗比亲本早69小时（89.5 vs 158.5 h），发酵时间改善56%
- 在20%乙醇暴露48小时后，亲本SB3的存活率比A90降低至少4个数量级
- 在13%乙醇的Pinot Noir葡萄酒中，A90完成MLF的时间为亲本的75%，在15%乙醇中为40%
- A90在50代传代后，在21%乙醇中仍保持乙醇耐受性
- hsp18在20%乙醇中两菌株表达均增加，但A90表达更高
研究结论
定向进化可以成功应用于O. oeni的非重组改良，获得乙醇耐受性提高的菌株A90，在葡萄酒中MLF性能显著提升，且hsp18等基因的表达差异与耐受性相关