Advancing metabolic engineering of Yarrowia lipolytica using the CRISPR/Cas system
- 作者
- Tian-Qiong Shi, He Huang, Eduard J. Kerkhoven, Xiao-Jun Ji
- 单位
- 南京工业大学生物技术与制药工程学院；南京工业大学药学院；南京工业大学材料化学工程国家重点实验室；江苏省先进材料协同创新中心；瑞典查尔姆斯理工大学生物学与生物工程系系统与合成生物学
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2018）
- DOI
- 10.1007/s00253-018-9366-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)代谢工程中传统基因操作工具（URA blast、Cre/LoxP、TALENs等）效率低、耗时长，难以满足高效、高通量基因组编辑的需求。
研究策略
系统综述CRISPR/Cas系统在解脂耶氏酵母中的开发与应用，包括Cas9/dCas9表达策略（质粒或基因组整合）、sgRNA表达策略（Pol II+核酶、Pol III启动子、T7系统、多基因sgRNA表达）、基因敲除/敲入以及基因抑制/激活（CRISPRi/CRISPRa）等，并列举了在脂质、糖原、木糖代谢等方面的应用案例。
研究路线图
核心内容
该文系统综述了CRISPR/Cas系统在解脂耶氏酵母代谢工程中的开发与应用进展。针对传统基因操作工具效率低、耗时长的问题，文章梳理了Cas9/dCas9及sgRNA的多种表达策略，包括质粒或基因组整合表达Cas9、Pol II加核酶、Pol III启动子及T7系统表达sgRNA等，并总结了基因敲除、敲入以及CRISPRi/CRISPRa调控手段。关键结果方面，过表达ACC1和DGA1使脂质含量达41.4%（为亲本株的4.7倍），引入醛脱氢酶后脂质含量最高达90%；SCR1-tRNAGly杂合启动子驱动sgRNA的编辑效率接近100%，单基因敲除频率近100%，三基因约19%。通过抑制NHEJ通路（ku70/ku80）可将同源重组效率提升至80%以上，HMEJ策略效率为HR的两倍；CRISPRa激活BGL1表达提高112倍。这些进展表明CRISPR/Cas系统已显著加速解脂耶氏酵母的菌株改造，但多基因编辑效率和高通量筛选仍有提升空间。
创新点
全面梳理了多种sgRNA表达策略和多基因编辑方案；提出了通过CRISPRi抑制NHEJ通路（ku70/ku80）以提升同源重组效率；建立了基于CRISPRa激活隐蔽糖代谢途径的方法；引入HMEJ、MMEJ等新型修复机制提升编辑效率。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | 脂质生物合成 | ACC1 | 乙酰辅酶A羧化酶 | 催化 | 过表达ACC1和DGA1使脂质含量达41.4%（4.7倍提高） |
| Yarrowia lipolytica | 脂质生物合成 | DGA1 | 二酰甘油酰基转移酶 | 催化 | 过表达ACC1和DGA1使脂质含量达41.4%（4.7倍提高） |
| Yarrowia lipolytica | 脂质生物合成 | — | 醛脱氢酶 | 催化 | 引入醛脱氢酶基因提高氧化应激抗性，脂质含量达90% |
| Yarrowia lipolytica | 木糖代谢 | XDH, XKS | 木糖醇脱氢酶、木酮糖激酶 | 催化 | CRISPR/Cas9敲除证明两者对木糖/木糖醇代谢必需 |
| Yarrowia lipolytica | NHEJ修复通路 | ku70 | Ku70 | 调控 | ku70缺陷可提高HR效率，50 bp同源臂效率43% |
| Yarrowia lipolytica | NHEJ修复通路 | ku80 | Ku80 | 调控 | ku80缺陷可提高HR效率，1 kb同源臂效率80% |
| Yarrowia lipolytica | 糖原合成 | — | 糖原合酶 | 催化 | 敲除糖原合酶基因后脂质含量提高60% |
| Yarrowia lipolytica | 色氨酸合成 | TRP1 | 磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶（TRP1） | 催化 | 作为选择标记被CRISPR/Cas9敲除 |
| Yarrowia lipolytica | 精氨酸转运 | CAN1 | 精氨酸通透酶 | 转运 | T7聚合酶系统敲除CAN1效率60% |
| Yarrowia lipolytica | 纤维二糖代谢 | BGL1 | β-葡萄糖苷酶1 | 催化 | CRISPRa激活后表达提高112倍 |
| Yarrowia lipolytica | 纤维二糖代谢 | BGL2 | β-葡萄糖苷酶2 | 催化 | CRISPRa激活后表达提高43倍 |
| Yarrowia lipolytica | CRISPR/Cas9基因编辑 | Cas9 | Cas9核酸酶 | 催化 | Cas9蛋白催化DNA双链断裂 |
| Yarrowia lipolytica | CRISPRi/CRISPRa | dCas9 | 去活化的Cas9 | 调控 | dCas9融合转录抑制/激活域实现基因调控 |
| Yarrowia lipolytica | CRISPR/Cas9（T7系统） | T7RNAP | T7 RNA聚合酶 | 催化 | 异源T7聚合酶转录sgRNA，编辑效率约60% |
关键发现
- 过表达ACC1和DGA1使脂质含量达41.4%（亲本株的4.7倍），引入醛脱氢酶基因后脂质含量最高达90%
- SCR1-tRNAGly杂合Pol III启动子驱动的sgRNA编辑效率接近100%
- T7聚合酶系统编辑效率约60%
- 单基因敲除频率近100%，双基因约36%，三基因约19%
- ku70缺陷菌株中50 bp同源臂HR效率达43%，ku80缺陷株1 kb同源臂HR效率80%，ku70缺陷最高85%
- 加入羟基脲后50 bp臂HR效率46%，100 bp臂达100%
- Holkenbrink等单基因敲除效率>80%，双基因6-66%，90 bp双链寡核苷酸修复效率100%
- Gao等HMEJ策略效率是HR的两倍
- CRISPRi抑制ku70/ku80后HR效率近90%
- dCpf1和dCas9基因抑制率分别为85%和92%
- CRISPRa激活BGL1表达提高112倍、BGL2提高43倍
- 敲除糖原合酶基因后脂质含量提高60%。
研究结论
CRISPR/Cas系统已在解脂耶氏酵母中成功建立并广泛应用于代谢工程，显著加速了基因组编辑和菌株改造；未来需进一步提高多基因编辑效率、实现更精准的位点定向突变以及开发高通量筛选技术。