Inactivation of the indole-diterpene biosynthetic gene cluster of Claviceps paspali by Agrobacterium-mediated gene replacement
- 作者
- László Kozák, Zoltán Szilágyi, Barbara Vágó, Annamária Kakuk, László Tóth, István Molnár, István Pócsi
- 单位
- Department of Biotechnology and Microbiology, Faculty of Science and Technology, University of Debrecen, Debrecen, Hungary; Teva Pharmaceutical Works Ltd., Debrecen, Hungary; Natural Products Center, School of Natural Resources and the Environment, University of Arizona, Tucson, USA
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2018）
- DOI
- 10.1007/s00253-018-8807-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Claviceps paspali 是重要的工业麦角碱生产菌，但其原生质体转化效率低、转化子有丝分裂不稳定，且吲哚-二萜（IDT）毒素的产生对麦角碱生产构成障碍。缺乏可靠的遗传操作工具来验证IDT生物合成基因簇的功能并改良工业菌株。
研究策略
优化并建立农杆菌介导转化（ATMT）方案，利用同源重组将IDT生物合成基因簇中的关键基因 idtCBGF 替换为潮霉素抗性基因 hph，构建基因敲除突变株；通过LC-MS/MS和HPLC验证IDT和麦角碱的产生情况。
研究路线图
核心内容
本研究针对麦角碱工业生产菌 Claviceps paspali 遗传操作工具缺乏、吲哚-二萜（IDT）毒素干扰生产的问题，建立了优化的农杆菌介导转化（ATMT）体系。通过同源重组将 IDT 生物合成基因簇中 idtCBGF 关键基因替换为潮霉素抗性标记，获得基因敲除突变株。优化后转化效率达约 80 个潮霉素抗性菌落/10 mg 湿菌丝，12 个转化子中 3 个确认发生位点特异性基因替换，同源重组比例约 33%。LC-MS/MS 分析显示，ΔidtCBGF 突变株中 paspaline、paxilline、paspalinine 及 paspalitrem A 和 B 等 IDT 产物完全消失，而总麦角碱产量（野生型 18.30±1.05 μg/g，突变株 19.09±1.30 和 18.41±0.50 μg/g）无显著差异，paspali acid 产量亦不受影响。该工作首次为 Claviceps 属建立高效 ATMT 体系，实现了 IDT 基因簇功能验证，证明可通过基因敲除彻底消除 IDT 污染而不损害麦角碱合成，为工业菌株改良提供了可行策略。
创新点
['首次为 Claviceps 属真菌建立并优化了 ATMT 遗传转化体系', '通过靶向基因替换实现了 C. paspali 中 IDT 生物合成基因簇的功能验证', '敲除突变株完全消除了IDT生物合成且不影响麦角碱产量，为工业菌株改良提供了新策略']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Claviceps paspali DSM-833 | 吲哚-二萜生物合成 | idtC | IdtC | 催化 | 异戊烯基转移酶，参与paspaline骨架组装，与PaxC同源 |
| Claviceps paspali DSM-833 | 吲哚-二萜生物合成 | idtB | IdtB | 催化 | 整合膜蛋白，推测参与环化步骤，与PaxB同源 |
| Claviceps paspali DSM-833 | 吲哚-二萜生物合成 | idtG | IdtG | 催化 | GGPP合酶，负责二萜前体合成，与PaxG同源 |
| Claviceps paspali DSM-833 | 吲哚-二萜生物合成 | idtF | IdtF | 催化 | 异戊烯基转移酶，催化paspalinine转化为paspalitrem A |
| Claviceps paspali DSM-833 | 吲哚-二萜生物合成 | idtM | IdtM | 催化 | FAD依赖单加氧酶，与PaxM同源，可能参与早期氧化 |
| Claviceps paspali DSM-833 | 吲哚-二萜生物合成 | idtP | IdtP | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，催化paspaline转化为13-deoxypaxilline |
| Claviceps paspali DSM-833 | 吲哚-二萜生物合成 | idtQ | IdtQ | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，催化C-13和C-7氧化，可能参与paxilline和paspalinine形成 |
关键发现
- ['优化后 ATMT 最高转化效率约为 80 个潮霉素抗性菌落/10 mg 湿菌丝（OD600=0.5，共培养4天）', '潮霉素最低抑制浓度为 200 μg/mL', '12个转化子中3个（CPIDT2、CPIDT8、CPIDT9）确认发生了位点特异性基因替换，1个（CPIDT5）为异核体，其余为异位整合；同源重组比例约为33%', 'ΔidtCBGF 突变株（CPIDT2、CPIDT8）的 LC-MS/MS 分析显示，paspaline、paxilline、paspalinine、paspalitrem A 和 B 均完全不再产生', '野生型总麦角碱产量为
- 30±1.05 μg/g，CPIDT2 为
- 09±1.30 μg/g，CPIDT8 为
- 41±0.50 μg/g，三者无显著差异；paspali acid 产量分别为
- 25±0.09、1.17±0.15、1.28±0.11 μg/g', 'idtG、idtM、idtB、idtC 编码蛋白分别与 Penicillium paxilli 中 PaxG、PaxM、PaxB、PaxC 的氨基酸一致性为 53%、38%、56%、45%']
研究结论
成功建立了 C. paspali 的高效农杆菌介导转化体系，通过同源重组敲除 IDT 生物合成基因簇关键基因，彻底阻断了 IDT 产生且不影响麦角碱合成。该体系可用于其他 Claviceps 菌株的遗传改良，并为工业麦角碱生产去除 IDT 污染提供了可行方案。