C/N ratio and carbon source-dependent lipid production profiling in Rhodotorula toruloides
- 作者
- Helberth Júnior Santos Lopes, Nemaiila Bonturi, Eduard Johannes Kerkhoven, Everson Alves Miranda, Petri-Jaan Lahtvee
- 单位
- Institute of Technology, University of Tartu, Tartu, Estonia; Department of Materials and Bioprocess Engineering, School of Chemical Engineering, State University of Campinas, Cidade Universitária Zeferino Vaz - Barão Geraldo, Campinas, SP 13083-970, Brazil; Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology, Göteborg, Sweden; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Chalmers University of Technology, Göteborg, Sweden
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2020）
- DOI
- 10.1007/s00253-020-10386-5
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
确定红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）利用低成本底物（木糖、乙酸、甘油）在不同碳氮比（C/N）条件下的最佳脂质生产条件，并解析其代谢机制。
研究策略
采用turbidostat连续培养模式在稳态下系统研究不同碳源（甘油、乙酸、木糖）和不同C/N比（60、80、100、120）对细胞生长和脂质积累的影响，结合分批和补料分批培养进行验证，并利用基因组规模代谢模型（rhto-GEM）进行通量平衡分析，预测理论产率、副产物及关键酶活性。
研究路线图
核心内容
本研究以红冬孢酵母CCT 0783为对象，系统考察了甘油、乙酸和木糖三种低成本碳源在不同碳氮比下的脂质生产性能。采用turbidostat连续培养模式获得稳态生理数据，避免批次培养中碳氮比动态变化造成的误差，并结合分批和补料分批实验及基因组规模代谢模型进行验证与机制解析。结果表明，提高碳氮比普遍降低比生长速率但增加脂质含量，其中木糖在碳氮比120时脂质含量最高达0.60 g/gDCW，甘油在碳氮比60至100区间比脂质生产率最高达0.085 g/gDCW·h，乙酸在碳氮比120时脂质含量达53%。木糖培养时约三分之一的碳流向木糖醇和阿拉伯醇，且高碳氮比下类胡萝卜素总量达353.7 μg/gDW并伴随组分比例改变。基因组模型预测甘油、木糖和乙酸的理论碳流向脂质最大产率分别为69%、61%和50%，而补料分批实验最高获得20.0 g/L脂质滴度，仅为理论产率约四分之一。该工作明确了不同底物的最佳生产条件及代谢瓶颈，提示通过强化苹果酸酶和磷酸酮醇酶等策略可进一步挖掘产脂潜力。
创新点
1. 利用turbidostat连续培养避免批次培养中C/N动态变化带来的生理波动，获得准确的稳态生理数据；2. 首次系统比较三种低成本底物在不同C/N下的脂质生产特性，并识别最优条件；3. 结合基因组规模代谢模型揭示不同碳源条件下的NADPH供应途径、潜在副产物和理论产率；4. 发现木糖高C/N下类胡萝卜素积累规律。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodotorula toruloides CCT 0783 | 甘油代谢 | — | NADPH-dependent glycerol dehydrogenase | 催化 | 甘油作为底物时通过该酶产生NADPH，是主要的NADPH来源。 |
| Rhodotorula toruloides CCT 0783 | 三羧酸循环 | — | NADPH-dependent isocitrate dehydrogenase | 催化 | 乙酸作为底物时NADPH的主要产生途径之一。 |
| Rhodotorula toruloides CCT 0783 | 脂肪酸生物合成 | — | Malic enzyme | 催化 | 提供NADPH，乙酸条件下贡献约5.5%的NADPH，其他碳源下几乎不使用。 |
| Rhodotorula toruloides CCT 0783 | 磷酸戊糖途径（氧化阶段） | — | Glucose 6-phosphate dehydrogenase | 催化 | 木糖作为底物时NADPH的主要来源。 |
| Rhodotorula toruloides CCT 0783 | 磷酸戊糖途径（氧化阶段） | — | Phosphogluconate dehydrogenase | 催化 | 木糖生长时产生NADPH的酶。 |
| Rhodotorula toruloides CCT 0783 | 木糖代谢 | — | Phosphoketolase | 催化 | 木糖和甘油代谢中提供乙酰辅酶A，木糖中20-32%碳经此途径，甘油中约20%。 |
| Rhodotorula toruloides CCT 0783 | 脂质合成（乙酰辅酶A合成） | — | ATP/citrate lyase (ACL) | 催化 | 木糖高C/N时最多32%碳经此酶，甘油时38%，乙酸时极低。 |
| Rhodotorula toruloides CCT 0783 | 乙酸同化 | — | Acetyl-CoA synthase | 催化 | 乙酸直接转化为乙酰辅酶A，用于脂肪酸合成。 |
关键发现
- 在turbidostat连续培养中，所有碳源下提高C/N比均导致比生长速率下降，但脂质含量增加
- 木糖在C/N 120时脂质含量最高达0.60 g/gDCW（60%）。甘油培养时，C/N 60-100间比脂质生产率最高达0.085 g/gDCW·h，C/N 60时最大比生长速率0.24 h⁻¹。乙酸培养时，C/N 60时生物量产率最高达0.47 gDW/g，C/N 120时脂质含量达53%
- C/N 80时比脂质生产率最高。木糖培养时，约1/3碳转化为木糖醇/阿拉伯醇
- C/N 120时类胡萝卜素总产量达353.7 μg/gDW，且β-胡萝卜素:圆酵母红素:红酵母烯比例从C/N 80的0.48:0.40:0.11变为C/N 120的0.17:0.34:0.32。基因组规模代谢模型预测理论最大脂质产率：甘油69%、木糖61%、乙酸50%的碳流向脂质。补料分批实验中，最高脂质滴度达20.0 g/L（μ0=0.03 h⁻¹）和17.1 g/L（μ0=0.05 h⁻¹），脂质含量约37-43%
- 分批实验中70 g/L甘油得到17.7 g/L生物量和42.13%脂质含量。在补料分批中，比脂质生产率（0.010 g/gDW·h）远低于turbidostat的0.085 g/gDW·h，但生物量和滴度更高。
研究结论
R. toruloides利用甘油时比脂质生产率最高，适合连续生产；木糖在高C/N下脂质含量最高且伴随有价值类胡萝卜素，适合联产；乙酸在低C/N时生物量产率较高。turbidostat连续培养能提供准确的生理参数，而补料分批可获得更高滴度。基因组模型显示目前仅达到理论最大产率的25%左右，通过代谢工程（如强化苹果酸酶和磷酸酮醇酶）和工艺优化可大幅提升脂质生产效率。