High-density immobilization of a ginsenoside-transforming β-glucosidase for enhanced food-grade production of minor ginsenosides
- 作者
- Chang-hao Cui, Byeong-Min Jeon, Yaoyao Fu, Wan-Taek Im, Sun-Chang Kim
- 单位
- Intelligent Synthetic Biology Center, 291 Daehak-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon 305-701, Korea; The Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, No. 101 Shanghai Road, Xuzhou, Jiangsu 221116, People's Republic of China; Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 291 Daehak-Ro, Yuseong-Gu, Daejeon305-701, Korea; Department of Biological Sciences, Hankyong National University, 327 Chungang-Ro, Anseong City, Kyonggi-Do 456-749, Korea; KAIST Institute for Biocentury, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 291 Daehak-Ro, Yuseon-Gu, Daejeon 305-701, Korea
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2019）
- DOI
- 10.1007/s00253-019-09951-4
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
稀有人参皂苷Compound K (CK)和F1在食品工业中具有重要应用，但传统重组酶生产存在表达宿主非GRAS、生产率低、酶浓度不足等问题，缺乏安全高效的食品级制备方法。
研究策略
采用GRAS菌株谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032表达新型β-葡萄糖苷酶MT619，并融合来自嗜热梭菌的纤维素结合模块C3a，通过一步固定化到再生无定形纤维素(RAC)上，实现酶的高密度浓缩和固定化，用于高效生物转化主要人参皂苷生成稀有皂苷CK和F1。
研究路线图
核心内容
本研究以GRAS菌株谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032为宿主，表达来自Microbacterium testaceum的新型β-葡萄糖苷酶MT619，并融合嗜热梭菌的纤维素结合模块C3a，通过一步吸附实现酶在再生无定形纤维素上的高密度固定化，用于食品级制备稀有人参皂苷CK和F1。结果显示，C3a-MT619在C. glutamicum中表达量占总蛋白的1.41%，重组酶最适pH 7.0、最适温度45℃。固定化最大吸附容量达984 mg/g RAC，酶浓度较细胞裂解液浓缩286倍；5000 mL放大实验中，66.0%的酶被固定，浓度提高61.8倍，经10次洗涤仍保留78%活性。以20 mg/mL PPDGM为底物，24 h内CK产量达7.86 g/L，摩尔收率79.2%；以75 mg/mL PPTGM为底物，F1产量达9.42 g/L。最终分离获得1.38 g CK和1.59 g F1。该策略实现了迄今报道的最高稀有皂苷产量，为功能性食品和化妆品行业提供了安全高效的生产途径。
创新点
['首次将重组酶固定化在纤维素上用于制备稀有人参皂苷', '使用GRAS宿主谷氨酸棒状杆菌表达食品级重组酶', '通过CBM-RAC吸附实现高密度固定化，酶浓度提高286倍', 'CK和F1产量达到迄今报道的最高水平']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum ATCC13032 | — | — | — | — | GRAS食品级宿主，用于表达融合蛋白C3a-MT619 |
| Escherichia coli BL21 | — | — | — | — | 用于10种候选糖苷酶的初步表达和筛选 |
| — | 人参皂苷去糖基化途径：PPD型 Rb1→GypXVII→GypLXXV/F2→CK→PPD；Rd→F2→CK→PPD；PPT型 Re→F1→PPT；Rg1→F1→PPT | — | MT619 | 催化 | MT619水解葡萄糖基，主要作用于C3位糖，产生CK和F1 |
| — | — | mt619 | MT619 | 催化 | 来自Microbacterium testaceum ATCC 15829的β-葡萄糖苷酶，全长1878 bp，编码625个氨基酸，分子量68.3 kDa |
| — | — | c3a（来自Clostridium thermocellum的纤维素结合模块） | C3a-MT619 | 区室化 | C3a通过(G4S)2柔性连接子融合至MT619 N端，全长2376 bp，编码791个氨基酸，分子量86.3 kDa，实现酶在RAC上的高密度固定化 |
| — | — | H36启动子 | — | 调控 | 在C. glutamicum中驱动C3a-MT619组成型表达 |
关键发现
- ['筛选到10种候选糖苷酶，其中MT619（来自Microbacterium testaceum ATCC 15829）活性最高，其F1生产活性是BgpA的7.4倍', '融合C3a的C3a-MT619在C. glutamicum ATCC13032中表达量占总蛋白的1.41±0.03%，约为E. coli中表达水平的21.5%，重组酶活性为E. coli表达酶的61.9%', 'MT619最适pH为7.0，最适温度为45℃，在37℃和45℃孵育2h后分别保留76.3%和54.9%活性', 'MT619对β-D-葡萄糖苷键具有严格底物特异性，仅水解PNP-β-D-吡喃葡萄糖苷和ONP-β-D-吡喃葡萄糖苷（后者相对活性28.7%）', '固定在RAC上的C3a-MT619最大吸附容量为984 mg/g RAC，酶浓度约为78.7 mg/mL RAC，比细胞裂解液浓缩286倍', '规模放大实验中，5000 mL细胞裂解液与50 mL RAC混合10 min，66.0%的C3a-MT619被固定化，浓度提高61.8倍，固定化酶经10次缓冲液洗涤后仍保留78.0%活性', '底物浓度优化：20 mg/mL PPDGM转化获得8.25 mg/mL CK
- 100 mg/mL PPTGM转化获得9.14 mg/mL F1', '放大生产：以20 mg/mL PPDGM为底物，24 h内CK产量达7.86 g/L（摘要中为7.59 g/L），摩尔收率79.2%
- 以75 mg/mL PPTGM为底物，24 h内F1产量达9.42 g/L，Rg1和Re转化率54.3%', '最终从反应混合物中分离得到1.38 g CK（色谱纯度51.6%）和1.59 g F1（色谱纯度25.2%）']
研究结论
本研究开发了一种安全、简便、高效的基于GRAS宿主C. glutamicum和纤维素固定化的食品级稀有人参皂苷生产方法，实现了CK和F1迄今最高的产量记录，证明该策略可用于从粗人参提取物高效制备CK和F1，为功能性食品和化妆品行业提供了可行的替代方案。