Identifying and engineering the ideal microbial terpenoid production host
- 作者
- Sandra Moser, Harald Pichler
- 单位
- Austrian Centre of Industrial Biotechnology; Graz University of Technology, Institute of Molecular Biotechnology
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2019）
- DOI
- 10.1007/s00253-019-09892-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
萜类化合物结构多样、应用广泛，但天然提取和化学合成受限于产量、成本与资源浪费，微生物生产作为一种可持续替代途径需要选择并改造合适的底盘宿主。
研究策略
系统综述了以大肠杆菌和酿酒酵母为主的多种微生物底盘在异源萜类生物合成中的研究进展，比较了单萜、倍半萜、二萜、三萜及四萜等不同类别萜类产物的生产水平，分析了前体供给、竞争途径、毒性耐受、细胞色素P450表达等工程挑战。
研究路线图
核心内容
该研究系统综述了微生物宿主在生产萜类化合物方面的工程进展，重点比较了大肠杆菌和酿酒酵母作为底盘的优势与局限，并考察了解脂耶氏酵母、毕赤酵母、甲基杆菌等替代宿主的潜力。作者梳理了单萜至四萜各类产物的最高产量记录，分析了前体供给、竞争途径、产物毒性及细胞色素P450表达等关键瓶颈。数据显示，工程酿酒酵母产β-法尼烯最高超过130 g/L，产青蒿酸达25 g/L；大肠杆菌产amorphadiene达27.4 g/L；通过减少18个ATP消耗、降低氧需求75%等代谢改造，显著提升了生产效率；原人参二醇在优化MVA途径和CYP450后产量达11.02 g/L。研究结论指出，尽管大肠杆菌和酿酒酵母仍是主流平台，但替代宿主经合理改造已接近工业水平，不同产物的最优宿主各异，需依据目标产物特性、底物利用方式和代谢工程难度综合选择底盘。该工作为萜类微生物制造的宿主选型与改造策略提供了系统参考。
创新点
系统比较了传统模式菌株与新兴替代宿主（如解脂耶氏酵母、毕赤酵母、甲烷甲基杆菌、红球菌等）在各类萜烯生产中的潜力；指出了通过改造中心碳代谢、降低ATP消耗和氧需求等手段实现超高产量的突破性案例；强调了底物利用（如CO2、甲醇、木质纤维素）对可持续生产的重要性。
研究对象（40）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP途径、异源MVA途径 | dxs, idi, MVA途径基因 | DXP合酶、异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 经典前体供给工程靶点，异源MVA途径显著提高前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径、麦角固醇合成途径 | tHMG, ERG20, ERG9 | 截短HMG-CoA还原酶、FPP合酶、角鲨烯合酶 | 催化 | 过表达tHMG和ERG20提高萜类产量；弱化ERG9减少竞争通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | tHMG1 | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 截短形式提高前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 中心碳代谢/乙酰-CoA供给 | ALD6, ACS*, ADH | 乙醛脱氢酶、乙酰-CoA合成酶变体、醇脱氢酶 | 能量供给 | PDH旁路工程提高乙酰-CoA，使amorphadiene产量提高2倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 中心碳代谢 | 磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶 | 来自Dickeya zeae的乙醛脱氢酶(ADA)、磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶 | 能量供给 | 替代内源途径减少ATP消耗18个ATP，氧需求降低75%，β-法尼烯产量>130 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 调控 | 通过降解标签降低蛋白水平以减少竞争 |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜生物合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 调控 | N端降解子靶向ERG20提高单萜产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 线粒体/胞质区室化 | 萜烯合酶 | 萜烯合酶 | 区室化 | 同时在线粒体和胞质表达萜烯合酶利用线粒体乙酰-CoA |
| Escherichia coli | 异源MVA途径（来自粪肠球菌和酿酒酵母） | MVA途径基因 | MVA途径酶 | 催化 | 杂合MVA途径优于天然MEP途径 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | BTS1 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达BTS1提高GGPP用于二萜合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | BTS1, DPP1 | GGPP合酶、二酰甘油二磷酸磷酸酶 | 催化 | 融合蛋白促进产物生成，产量3.3 g/L geranylgeraniol |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | CYP450/CPR | 细胞色素P450及其还原酶 | 催化 | CYP450表达优化显著提高原人参二醇产量至11.02 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 内源三萜前体合成关键酶 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径/脂质代谢 | FPP合酶/α-法尼烯合酶融合 | FPP合酶、α-法尼烯合酶 | 催化 | 融合蛋白提高α-法尼烯产量至260 mg/L |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素生物合成 | carotenogenic genes | 类胡萝卜素合成酶 | 催化 | β-胡萝卜素产量达90 mg/g DCW |
| Pichia pastoris | 倍半萜生物合成 | valencene synthase, CYP450/CPR | 瓦伦烯合酶、细胞色素P450/还原酶 | 催化 | 产(+)-诺卡酮208 mg/L |
| Methylobacterium extorquens | 甲醇代谢/倍半萜合成 | α-humulene synthase | α-蛇麻烯合酶 | 催化 | 以甲醇为碳源产α-蛇麻烯1.65 g/L |
| Pseudomonas putida | 单萜生物合成 | geranic acid pathway | 单萜合成相关酶 | 催化 | 产牻牛儿酸193 mg/L，对单萜耐受性比酿酒酵母和大肠杆菌高至少6倍 |
| Corynebacterium glutamicum | MEP途径/类胡萝卜素合成 | carotenogenic genes | 类胡萝卜素合成酶 | 催化 | 产番茄红素、角鲨烯等，产量较低 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 光合作用/萜类合成 | terpene synthases | 萜烯合酶 | 催化 | 以CO2为碳源产β-石竹烯、二萜等 |
| Rhodobacter sphaeroides | MVA途径（异源） | valencene synthase | 瓦伦烯合酶 | 催化 | 产瓦伦烯352 mg/L |
| Bacillus subtilis | MEP途径/倍半萜合成 | amorphadiene synthase | 阿莫尔法二烯合酶 | 催化 | 产amorphadiene 20 mg/L |
| Cupriavidus necator | CO2固定/萜类合成 | α-humulene synthase | α-蛇麻烯合酶 | 催化 | 以CO2为唯一碳源产α-蛇麻烯17 mg/g DCW |
| Streptomyces avermitilis | 类胡萝卜素合成 | lycopene pathway | 番茄红素合成酶 | 催化 | 番茄红素产量82 mg/g DCW |
| Escherichia coli | 异源MVA途径 | CYP450/CPR | 细胞色素P450及其还原酶 | 催化 | 用于功能性修饰，如产8-羟基卡地烯105 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | ERG20, tHMG | FPP合酶、HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达提高前体供给 |
| Escherichia coli | 单萜生物合成 | GPP synthase (heterologous) | 牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 异源GPP合酶提高单萜前体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜生物合成 | ERG20 mutant | FPP合酶突变体 | 催化 | 工程化改造偏向产生GPP |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | HMG2 (K6R) | HMG-CoA还原酶异构酶稳定变体 | 催化 | 提高桉叶油素产量至1.1 g/L |
| Escherichia coli | MVA途径（杂合） | sabinene synthase | 松烯合酶 | 催化 | 产松烯2.65 g/L |
| Escherichia coli | MVA途径（杂合） | limonene synthase | 柠檬烯合酶 | 催化 | 产柠檬烯0.9 g/L |
| Escherichia coli | MVA途径（杂合） | α-pinene synthase | α-蒎烯合酶 | 催化 | 产α-蒎烯0.97 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | amorphadiene synthase | 阿莫尔法二烯合酶 | 催化 | 产amorphadiene >40 g/L |
| Escherichia coli | MVA途径（异源） | amorphadiene synthase | 阿莫尔法二烯合酶 | 催化 | 产amorphadiene 27.4 g/L |
| Escherichia coli | MVA途径 | β-farnesene synthase | β-法尼烯合酶 | 催化 | 产β-法尼烯8.74 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | dammarenediol synthase, CYP450 | 达玛烯二醇合酶、细胞色素P450 | 催化 | 产原人参二醇11.02 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | UDP-glycosyltransferases | UDP-糖基转移酶 | 催化 | 糖基化修饰人参皂苷，产Rh2 2.25 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | CYP716A, CPR | 细胞色素P450与还原酶 | 催化 | 产齐墩果酸607 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 三萜生物合成 | β-amyrin synthase | β-香树脂醇合酶 | 催化 | 产β-香树脂醇 |
| Pichia pastoris | 三萜生物合成 | squalene-related genes | 角鲨烯合酶等 | 催化 | 产(+)-ambrein 105 mg/L |
关键发现
- 超过70000种萜类结构已知
- 当前产量最高的是工程酿酒酵母产β-法尼烯，达>130 g/L
- 酿酒酵母产青蒿酸前体amorphadiene超过40 g/L，青蒿酸达25 g/L
- 大肠杆菌产amorphadiene达27.4 g/L，β-法尼烯达8.74 g/L
- 酿酒酵母产原人参二醇达11.02 g/L（76.9 mg/g DCW），人参皂苷Rh2达2.25 g/L
- 解脂耶氏酵母产β-胡萝卜素达90 mg/g DCW
- 大肠杆菌产番茄红素报道达448 mg/g DCW但受质疑
- 酿酒酵母产β-胡萝卜素达150 mg/g DCW
- 产β-紫罗兰酮方面大肠杆菌产500 mg/L、解脂耶氏酵母产380 mg/L
- 大肠杆菌产视黄醛达600 mg/L
- 毕赤酵母产(+)-诺卡酮达208 mg/L
- 甲基杆菌产α-蛇麻烯达1.65 g/L
- 大肠杆菌产松烯2.65 g/L、柠檬烯0.9 g/L、α-蒎烯0.97 g/L
- 酿酒酵母产香叶醇1.68 g/L、桉叶油素1.1 g/L
- 恶臭假单胞菌产牻牛儿酸193 mg/L
- 工程改造酿酒酵母使β-法尼烯生产过程中ATP消耗减少18个ATP，氧需求降低75%
- 通过模块化MVA途径和CYP450优化使原人参二醇产量达11.02 g/L。
研究结论
大肠杆菌和酿酒酵母仍是目前最成熟的萜类生产宿主，但越来越多替代微生物通过合理工程改造已能达到或接近工业化水平；不同萜类的最适宿主不同，需根据目标产物、底物利用、CYP450功能表达、产物耐受性及专利自由度等综合选择底盘；未来需要进一步优化途径动态调控、提高萜类合酶活性并深入理解重组生产对宿主代谢的影响。