Investigation of monoterpenoid resistance mechanisms in Pseudomonas putida and their consequences for biotransformations
- 作者
- Florence Miramella Schempp, Katharina Elisabeth Hofmann, Jia Mi, Ferdinand Kirchner, Annika Meffert, Hendrik Schewe, Jens Schrader, Markus Buchhaupt
- 单位
- DECHEMA-Forschungsinstitut, Industrial Biotechnology, Theodor-Heuss-Allee 25, 60486 Frankfurt am Main, Germany; Faculty Biological Sciences, Goethe University Frankfurt, Max-von-Laue-Str. 9, 60438 Frankfurt am Main, Germany
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2020）
- DOI
- 10.1007/s00253-020-10566-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析Pseudomonas putida GS1对单萜类化合物高耐受性的分子机制，并探究该机制对单萜生物转化过程的影响。
研究策略
通过转座子诱变和适应性进化获得对1,8-桉叶素、香叶酸、香叶醇、α-松油醇和马鞭草酮的高耐受突变株，结合全基因组测序、qPCR、外排活性检测和基因缺失/回补实验鉴定关键基因，并通过香叶醇到香叶酸的生物转化实验评估耐受性改变对生产性能的影响。
研究路线图
核心内容
该研究以恶臭假单胞菌GS1为对象，系统解析其对单萜类化合物的耐受机制。通过转座子诱变和适应性进化获得对1,8-桉叶素、香叶酸、香叶醇等的高耐受突变株，结合全基因组测序、qPCR、外排活性检测及基因缺失/回补实验，鉴定出TtgABC和TtgDEF外排泵是耐受性的核心介导因子。研究发现不同突变通过上调外排泵表达提高耐受，但一个意外的发现是ttgA基因缺失导致外排活性降低的GAR突变株反而对香叶酸耐受性提高，据此提出无效循环假说。在香叶醇至香叶酸的生物转化实验中，野生型38小时产香叶酸约16 mM（得率45%），而外排活性降低的GAR突变株产量达32 mM，得率提升至91%。该结果揭示了外排泵活性与生物转化效率间的矛盾关系，表明耐受性改造需针对特定产物精细调控转运系统，而非简单增强外排，为单萜类化合物的高效生物转化提供了新的设计思路。
创新点
['系统揭示了P. putida GS1对多种单萜化合物的耐受性主要依赖于TtgABC和TtgDEF外排泵，并鉴定了多个相关突变。', '意外发现降低TtgABC外排泵活性（GAR突变株）反而提高对香叶酸的耐受性，提出futile cycle假说。', '证明高外排活性会损害香叶醇向香叶酸的生物转化，而降低外排活性可使产物得率从45%提升至91%，表明耐受性改造需要精细调控。']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida GS1 | 单萜外排/耐受 | ttgA | TtgA | 转运 | TtgABC外排泵脂蛋白组分；GAR突变株中41 nt缺失导致功能丧失，意外提高香叶酸耐受 |
| Pseudomonas putida GS1 | 单萜外排/耐受 | ttgB | TtgB | 转运 | TtgABC外排泵内膜转运亚基 |
| Pseudomonas putida GS1 | 单萜外排/耐受 | ttgC | TtgC | 转运 | TtgABC外排泵外膜通道亚基 |
| Pseudomonas putida GS1 | 单萜外排/耐受 | ttgD | TtgD | 转运 | TtgDEF外排泵脂蛋白组分 |
| Pseudomonas putida GS1 | 单萜外排/耐受 | ttgE | TtgE | 转运 | TtgDEF外排泵内膜转运亚基 |
| Pseudomonas putida GS1 | 单萜外排/耐受 | ttgF | TtgF | 转运 | TtgDEF外排泵外膜通道亚基 |
| Pseudomonas putida GS1 | 单萜外排/耐受 | ttgR | TtgR | 调控 | TtgABC操纵子的转录抑制因子；CR突变株中转座子插入导致功能丧失 |
| Pseudomonas putida GS1 | 单萜外排/耐受 | ttgT | TtgT | 调控 | TtgDEF操纵子的转录抑制因子；GR突变株中转座子插入导致功能丧失 |
| Pseudomonas putida GS1 | 呼吸链/能量代谢 | nuoB | NuoB | 能量供给 | NADH-醌氧化还原酶（NADH脱氢酶）亚基；VR1突变株中发生点突变 |
| Pseudomonas putida GS1 | 呼吸链/能量代谢 | nuoG | NuoG | 能量供给 | NADH-醌氧化还原酶（NADH脱氢酶）亚基；VR2突变株中发生点突变 |
关键发现
- ['野生型P. putida GS1可耐受200 mM的烃类单萜（月桂烯、α-萜品烯、γ-萜品烯）和100 mM的酯类单萜（香叶醇乙酸酯、甲酸香叶酯、α-萜品醇乙酸酯），生长不受明显影响。', '马鞭草酮（35 mM）、α-松油醇（60 mM）和4-萜品醇（80 mM）对P. putida GS1的抑制作用最强，导致滞后期延长超过10 h。', "获得的高耐受突变株中，CR（ttgR转座子插入）、TR（ttgABC 5'-UTR 10 nt缺失）、GR（ttgT转座子插入）通过上调TtgABC或TtgDEF外排泵表达提高耐受性。", 'GAR突变株（ttgA基因缺失41 nt导致功能丧失）对香叶酸的耐受性提高，但对其他单萜更敏感
- 其外排活性较野生型降低。', 'VR1和VR2突变株为增变菌株（分别含mutS和mutL突变），均携带nuoB或nuoG突变，并表现出TtgABC和TtgDEF表达上调。', '在香叶醇（35 mM）到香叶酸的生物转化中，野生型38 h产香叶酸约16 mM（得率45%），TR突变株仅9.5 mM，而GAR突变株达32 mM（得率91%）。']
研究结论
P. putida GS1对单萜类化合物的耐受性主要由TtgABC和TtgDEF外排泵介导，不同突变通过改变外排活性产生不同特异性的耐受表型。降低特定外排活性可提高香叶酸等产物的生物转化效率，表明菌株耐受性改造需要基于对转运机制的知识进行精细调控，以实现高效稳健的生物转化过程。