Engineering of a borneol dehydrogenase from P. putida for the enzymatic resolution of camphor
- 作者
- Michael Hofer, Julia Diener, Benjamin Begander, Robert Kourist, Volker Sieber
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2021）
- DOI
- 10.1007/s00253-021-11239-5
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏能够高效、对映选择性还原樟脑以获得光学纯(-)-樟脑的酶；目前(-)-樟脑天然来源有限，氧化(-)-龙脑成本高，化学合成得到外消旋体需酶法动力学拆分
研究策略
从恶臭假单胞菌ATCC 17453克隆首个能还原樟脑的龙脑脱氢酶（BDH），通过同源建模和底物对接确定活性位点邻近残基，进行定点饱和突变（半理性）创建突变体库，筛选高对映选择性变体，并与葡萄糖脱氢酶偶联实现辅因子循环，进行樟脑外消旋体的酶法动力学拆分
研究路线图
核心内容
该研究从恶臭假单胞菌ATCC 17453中克隆了首个能还原樟脑的龙脑脱氢酶（BDH），并针对其催化樟脑外消旋体动力学拆分效率低的问题进行半理性改造。通过同源建模与底物对接确定活性位点邻近残基，对关键氨基酸实施定点饱和突变，筛选出高对映选择性变体，并与葡萄糖脱氢酶偶联实现辅因子再生。野生型BDH对(+)/(-)-龙脑的Km分别为0.095和0.115 mM，但E值仅1.7。单突变体Y188T及双突变体S146A/Y188T的E值均超过100，其中双突变体转化率达40%，kcat提升至3.32 s⁻¹。在酶法动力学拆分中，2.5小时内超过99%的(+)-樟脑被转化，eeS大于99%，最终获得79%的高光学纯度(-)-樟脑。该工作首次实现了通过酶工程改造获得高对映选择性BDH变体，为樟脑外消旋体的绿色拆分提供了可行途径，但产物绝对收率仍受限于酶活，后续需进一步改造以推动工业应用。
创新点
首次报道能催化樟脑还原为龙脑的龙脑脱氢酶；通过定点突变获得E值>100的对映选择性变体；实现酶法动力学拆分樟脑外消旋体，得到高光学纯度(-)-樟脑
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas sp. ATCC 17453 | 樟脑降解途径 | bdh | 龙脑脱氢酶（BDH） | 催化 | 首个能还原樟脑的BDH，野生型无对映选择性（E=1.7） |
| E. coli BL21(DE3) | 龙脑氧化/樟脑还原 | bdh（Y188T） | BDH_Y188T | 催化 | 单突变体，对(+)-樟脑E>100，转化率22% |
| E. coli BL21(DE3) | 龙脑氧化/樟脑还原 | bdh（S146A/Y188T） | BDH_S146A/Y188T | 催化 | 最佳双突变体，E>100，转化率40%，kcat(+)-龙脑3.32 s^-1 |
| Pseudomonas sp. (商品酶) | 葡萄糖代谢 | — | 葡萄糖脱氢酶（GDH） | 能量供给 | 用于NADH辅因子再生，Km(glucose)=3.6 mM，kcat=1.3 s^-1 |
关键发现
- 野生型BDH对(+)/(-)-龙脑的Km分别为0.095±0.004 mM和0.115±0.002 mM，kcat分别为0.89和0.97 s^-1
- 对NAD的Km为0.06±0.005 mM。对(+)-樟脑比活力0.2 U/mg，(-)-樟脑0.18 U/mg（1 mM底物）。野生型E=1.7。单突变体Y188T和Y188A的E值>100。双突变体S146A/Y188T和S146A/Y188A的E值>100，转化率分别为40%和39%，kcat(+)-龙脑分别为3.32和1.51 s^-1。酶法动力学拆分2.5 h后，>99%的(+)-樟脑被转化，eeP为75.1%，得到79%的(-)-樟脑，eeS>99%
研究结论
利用恶臭假单胞菌的龙脑脱氢酶，通过半理性工程改造，获得了高对映选择性变体，实现了樟脑外消旋体的酶法动力学拆分，得到高光学纯度(-)-樟脑，但总收率受限于酶活，需进一步酶工程改造以实现经济可行的去消旋化过程