Generation of stable homozygous transformants of diploid yeasts such as Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- Gerhard Sandmann
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2022）
- DOI
- 10.1007/s00253-022-12054-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
二倍体酵母如Xanthophyllomyces dendrorhous遗传转化后通常产生杂合转化子，由于有丝分裂重组导致遗传不稳定，且基因失活因未完全破坏而呈现中间表型，阻碍工业应用
研究策略
通过自发有丝分裂重组选择或诱导减数分裂（有性生殖周期）将杂合转化子转化为纯合系，以获得稳定且完全通路阻断的工程菌株
研究路线图
核心内容
针对二倍体酵母遗传转化后杂合子不稳定、基因失活不完全的问题，该研究以产虾青素的法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）为对象，系统建立了将杂合转化子转化为纯合稳定菌株的策略。野生型菌株虾青素含量约200 μg/g干重，杂合转化子在无选择压力培养下会快速回复为野生型表型，而通过自发有丝分裂重组筛选或诱导减数分裂获得纯合子后，crtI基因失活的纯合八氢番茄红素积累株在无选择压力下发酵培养超过20代仍保持遗传稳定。有丝分裂中crtI基因重组率为0.3%，经性周期产生的白色纯合子中crtI条带完全消失，证实基因座为纯合状态。该策略有效解决了二倍体酵母工程菌株的遗传不稳定与中间表型问题，为工业生产提供稳定底盘，并可推广至圆红冬孢酵母、产朊假丝酵母及马克斯克鲁维酵母等其他二倍体工业菌株。
创新点
系统阐述了针对二倍体酵母杂合问题的纯合化策略，包括利用有丝分裂重组选择纯合子、通过性周期进行减数分裂分离纯合子，并指出该方法可推广至其他二倍体酵母
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase） | 催化 | 类胡萝卜素途径中的八氢番茄红素脱氢酶，其失活导致八氢番茄红素积累 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | astaxanthin synthase | 虾青素合酶 | 催化 | 参与虾青素合成，与潮霉素抗性基因一起整合 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甾醇生物合成 | C-22 sterol desaturase gene (CYP61) | C-22甾醇脱饱和酶 | 催化 | 失活该基因后可通过增加选择剂浓度筛选纯合菌株 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | asy | — | 催化 | 通过连续双重转化失活该基因，使等位基因完全失活 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | mevalonate pathway genes | — | 催化 | 过表达三个甲羟戊酸途径基因以提高虾青素前体供应 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | rDNA | — | 区室化 | 用于整合外源基因，理论上有61个拷贝位点 |
关键发现
- X. dendrorhous野生型虾青素含量约200 μg/g干重
- crtI基因在有丝分裂中的重组率为0.3%
- 纯合八氢番茄红素积累转化子在无选择压力发酵培养中稳定超过20代
- 杂合转化子在无选择压力下快速回复为野生型表型
- 通过性周期产生白色纯合子（ST），其crtI条带消失，证明纯合状态
研究结论
通过有丝分裂或减数分裂重组获得纯合转化子可解决二倍体酵母的遗传不稳定和基因失活不完全问题，为工业发酵生产奠定基础，并适用于其他二倍体酵母如Rhodosporidium toruloides、Candida utilis、Kluyveromyces marxianus等