Aromatic secondary metabolite production from glycerol was enhanced by amino acid addition in Pichia pastoris
- 作者
- Ryota Kumokita, Takanobu Yoshida, Tomokazu Shirai, Akihiko Kondo, Tomohisa Hasunuma
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2023）
- DOI
- 10.1007/s00253-023-12798-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明Pichia pastoris以甘油为碳源时比葡萄糖更高产芳香族次级代谢物的机制，以及氨基酸在这一过程中的作用。
研究策略
比较葡萄糖与甘油为碳源时P. pastoris生产对香豆酸、柚皮素和白藜芦醇的产量；在含/不含氨基酸的合成培养基中进行发酵；通过胞内和胞外代谢物的时间序列分析（LC-MS/MS）揭示代谢变化；在甘油培养基中单独添加氨基酸，筛选能提高白藜芦醇产量的氨基酸。
研究路线图
核心内容
该研究以毕赤酵母（Pichia pastoris）为底盘，通过代谢工程改造莽草酸途径及下游合成模块（包括DAHP合酶K229L突变体、分支酸变位酶G141S突变体、酪氨酸解氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、二苯乙烯合酶及查尔酮合酶/异构酶），探究了以甘油替代葡萄糖为碳源时芳香族次级代谢物高产的原因。研究发现，在自然复合培养基中，以甘油替代葡萄糖使对香豆酸、柚皮素和白藜芦醇的产量分别提高103%（45 mg/L→92 mg/L）、118%（136 mg/L→297 mg/L）和157%（176 mg/L→452 mg/L）；在含氨基酸的合成培养基中提升更为显著（153%、298%、275%）。通过LC-MS/MS代谢物时间序列分析，发现甘油培养条件下细胞对培养基中多种氨基酸的消耗加快；单独添加天冬氨酸或色氨酸可使白藜芦醇产量分别提高146%和156%，同时胞内莽草酸途径中间代谢物（如DHQ、DHS、莽草酸、酪氨酸）积累增加。结果表明，P. pastoris在甘油为碳源时可利用特定氨基酸增强莽草酸途径代谢流，进而高效合成芳香族次级代谢物，为优化氨基酸组合和浓度以进一步提高产量提供了理论基础。
创新点
发现P. pastoris仅在甘油为碳源时才会利用培养基中的氨基酸以增强芳香族次级代谢物合成；通过代谢组学揭示添加天冬氨酸或色氨酸可显著提高莽草酸途径代谢物积累及白藜芦醇产量。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435衍生菌株 | 莽草酸途径 | ARO4K229L | 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase (DAHP synthase, K229L mutant) | 催化 | 反馈抑制抗性突变体，来自酿酒酵母，过表达以增强莽草酸途径通量 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435衍生菌株 | 莽草酸途径 | ARO7G141S | Chorismate mutase (G141S mutant) | 催化 | 反馈抑制抗性突变体，来自酿酒酵母，过表达以增强分支酸向下游酪氨酸方向转化 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435衍生菌株 | 对香豆酸生物合成途径 | TAL | Tyrosine ammonia-lyase | 催化 | 异源表达，催化酪氨酸转化为对香豆酸 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435衍生菌株 | 白藜芦醇生物合成途径 | 4CL | 4-coumarate CoA ligase | 催化 | 异源表达，催化对香豆酸生成对香豆酰辅酶A |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435衍生菌株 | 白藜芦醇生物合成途径 | STS | Stilbene synthase | 催化 | 异源表达，催化对香豆酰辅酶A生成白藜芦醇 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435衍生菌株 | 柚皮素生物合成途径 | CHS | Chalcone synthase | 催化 | 异源表达，催化对香豆酰辅酶A生成柚皮素查尔酮 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435衍生菌株 | 柚皮素生物合成途径 | CHI | Chalcone isomerase | 催化 | 异源表达，催化查尔酮异构化生成柚皮素 |
关键发现
在自然复合培养基中，以甘油代替葡萄糖，对香豆酸产量增加103%（45 mg/L → 92 mg/L），柚皮素增加118%（136 mg/L → 297 mg/L），白藜芦醇增加157%（176 mg/L → 452 mg/L）。在含氨基酸的合成培养基（SCG vs SCD）中，三种产物分别增加153%、298%和275%。在SG培养基中单独添加天冬氨酸或色氨酸，白藜芦醇产量分别提高146%和156%。代谢组学显示，添加Asp或Trp后胞内莽草酸途径代谢物（DHQ、DHS、莽草酸、酪氨酸）浓度升高，而多种氨基酸在培养基中消耗加快。
研究结论
P. pastoris以甘油为碳源时，通过增强特定氨基酸的利用，提高莽草酸途径代谢流，从而高产芳香族次级代谢物。该研究为通过优化氨基酸组合和浓度进一步提升P. pastoris芳香族次级代谢物产量提供了基础。