High-level biosynthesis of enantiopure germacrene D in yeast
- 作者
- Shubha Sharma, Seema Chaurasia, Sandeep Dinday, Gaurav Srivastava, Anamika Singh, Chandan Singh Chanotiya, Sumit Ghosh
- 单位
- Plant Biotechnology Division, Council of Scientific and Industrial Research- Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CSIR- CIMAP), Lucknow 226015, India; Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), Ghaziabad 201002, India; Present Address: School of Agricultural Biotechnology, Punjab Agricultural University, Ludhiana 141004, India; Phytochemistry Division, Council of Scientific and Industrial Research- Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CSI- CIMAP), Lucknow 226015, India
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-023-12885-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在酵母中实现高产量、对映体纯的(+)-和(-)-germacrene D生物合成，摆脱对植物提取的依赖，满足香料工业的可持续供应需求。
研究策略
对酿酒酵母进行系统代谢工程改造：过表达ERG通路中8个酶（ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、ERG19、IDI、ERG20）以增强FPP前体供应；用铜抑制性启动子P_CTR3替换ERG9启动子以限制FPP流向麦角固醇竞争通路；敲除GAL80实现组成型表达；在GAL80、LPP1和rDNA位点多拷贝整合密码子优化的Solidago canadensis germacrene D合酶（ScaGerD(+)和ScaGerD(-)）；并过表达Yarrowia lipolytica ATP-柠檬酸裂解酶（YlACL）将线粒体柠檬酸池偶联至胞质乙酰-CoA，进一步提高FPP通量。
研究路线图
核心内容
本研究针对植物提取供应不足的问题，对酿酒酵母进行系统代谢工程改造，以实现对映体纯(+)-和(-)-germacrene D的高水平生物合成。策略上过表达ERG通路中8个关键酶以增强FPP前体供应，同时用铜抑制性启动子替换ERG9启动子削弱竞争性麦角固醇支路，并敲除GAL80实现组成型表达，此外还将密码子优化的Solidago canadensis germacrene D合酶多拷贝整合至GAL80、LPP1及rDNA位点。研究还创新性地引入oleaginous酵母Yarrowia lipolytica的ATP-柠檬酸裂解酶，将线粒体柠檬酸池偶联至胞质乙酰-CoA以进一步提升通量。关键结果方面，组成型菌株CENses8(-D)无需诱导剂即可产生728.87 μg/ml的(-)-germacrene D，较亲本提高数十倍；进一步表达YlACL后，在葡萄糖补料分批摇瓶发酵中(+)-和(-)-germacrene D产量分别达290.28 μg/ml和2519.46 μg/ml，为迄今摇瓶发酵最高水平。这些结果意味着通过整合前体强化、竞争抑制和多拷贝合酶表达及代谢偶联策略，已成功构建无需诱导剂、高产且对映体纯的germacrene D酵母生产平台，具备显著工业规模化潜力。
创新点
首次在ERG通路工程酵母中过表达oleaginous酵母的ATP-柠檬酸裂解酶；通过敲除GAL80构建无需诱导剂的组成型对映体纯germacrene D生产平台；实现迄今摇瓶发酵中(+)-和(-)-germacrene D的最高产量。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | ERG10 | ERG10（乙酰-CoA C-乙酰转移酶） | 催化 | 过表达以增强乙酰-CoA转化为乙酰乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | ERG13 | ERG13（HMG-CoA合酶） | 催化 | 过表达以增强HMG-CoA合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | tHMG1 | tHMG1（截短的HMG-CoA还原酶） | 催化 | 过表达截短形式（去除N端调控域）以消除反馈抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | ERG12 | ERG12（甲羟戊酸激酶） | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | ERG8 | ERG8（磷酸甲羟戊酸激酶） | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | ERG19 | ERG19（二磷酸甲羟戊酸脱羧酶） | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | IDI | IDI（异戊烯基二磷酸异构酶） | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | ERG20 | ERG20（法尼基焦磷酸合酶） | 催化 | 过表达以直接生成FPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸/ERG通路 | ERG9 | ERG9（角鲨烯合酶） | 催化 | 其天然启动子被替换为铜抑制性启动子P_CTR3，以限制FPP流向麦角固醇竞争通路 |
| Saccharomyces cerevisiae | 半乳糖代谢/GAL调控 | GAL80 | GAL80（GAL基因转录抑制因子） | 调控 | 敲除以实现GAL启动子组成型激活，无需半乳糖诱导 |
| Saccharomyces cerevisiae | 萜类前体代谢 | LPP1 | LPP1（脂质磷酸磷酸酶） | 催化 | 敲除以减少FPP去磷酸化消耗，提高FPP用于germacrene D合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | ScaGerD(+) | (+)-germacrene D合酶 | 催化 | 来自Solidago canadensis，密码子优化，多拷贝整合于GAL80、LPP1和rDNA位点 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | ScaGerD(-) | (-)-germacrene D合酶 | 催化 | 来自Solidago canadensis，密码子优化，多拷贝整合于GAL80、LPP1和rDNA位点 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰-CoA供应 | YlACL1 | YlACL1（ATP-柠檬酸裂解酶亚基1） | 催化 | 来自Yarrowia lipolytica，密码子优化，过表达以增强胞质乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰-CoA供应 | YlACL2 | YlACL2（ATP-柠檬酸裂解酶亚基2） | 催化 | 来自Yarrowia lipolytica，密码子优化，与YlACL1共同形成功能性ATP-柠檬酸裂解酶 |
关键发现
- 工程菌CENses5C(+D)和CENses5C(-D)经半乳糖诱导后，(+)-和(-)-germacrene D产量分别达34.77 μg/ml和158.06 μg/ml，比亲本CEN0提高约30倍和13倍
- 组成型菌株CENses8(+D)和CENses8(-D)无需半乳糖即可产生41.36 μg/ml和728.87 μg/ml
- 进一步表达YlACL后，CENses8(+D)*和CENses8(-D)*产量提升至137.71 μg/ml和815.81 μg/ml，为亲本CEN.PK2.1C的67-120倍
- 在葡萄糖补料分批摇瓶发酵中，CENses8(+D)*和CENses8(-D)**分别产生290.28 μg/ml和2519.46 μg/ml的(+)-和(-)-germacrene D，为迄今摇瓶发酵最高产量。CENses6(-D)产量比CENses5C(-D)高3.6倍，CENses7(+D)比CENses6(+D)高4.81倍。此外，CENses7(+D)在48h时产量25.96 μg/ml，CENses8(+D)在120h时产量201.37 μg/ml。
研究结论
通过综合代谢工程策略，包括敲除GAL80和LPP1、过表达8个ERG酶、多拷贝整合germacrene D合酶及偶联ATP-柠檬酸裂解酶，成功实现了酿酒酵母中组成型、高产量、对映体纯的(+)-和(-)-germacrene D生物合成，摇瓶产量为迄今最高，为工业规模化生产奠定了基础。