Adaptive laboratory evolution for improved tolerance of vitamin K in Bacillus subtilis
- 作者
- Xiumin Ding, Zhiming Zheng, Genhai Zhao, Li Wang, Han Wang, Peng Wang
- 单位
- Institute of Intelligent Machines, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences; Department of Health Inspection and Quarantine, Wannan Medical College; University of Science and Technology of China
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-023-12877-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
MK-7的氧化活性对微生物自身的积累产生抑制作用，限制了其在工业化生产中的产量，需要提高底盘细胞对维生素K的耐受性。
研究策略
以维生素K3（VK3）作为MK-7的结构类似物，对产MK-7的枯草芽孢杆菌BS011进行适应性实验室进化（ALE），通过逐步提高VK3浓度筛选出耐受性显著提高的进化菌株BS012，并结合基因组重测序和转录组分析揭示其分子机制。
研究路线图
核心内容
针对维生素K2（MK-7）氧化活性对底盘细胞自身积累的抑制作用，该研究以维生素K3（VK3）为结构类似物，对产MK-7的枯草芽孢杆菌BS011开展适应性实验室进化（ALE），通过逐步提高VK3浓度筛选获得耐受性显著提升的进化菌株BS012，将VK3耐受浓度从6.0 mg/L提升至60.0 mg/L。结合基因组重测序与转录组分析，发现BS012通过细胞形态改变、抗氧化系统增强、碳氮代谢重塑及孢子形成相关基因调控等多层面机制实现耐受。静态培养中BS012生物膜内MK-7含量达1.51 μg/mg，较原始菌株提高75.71%；摇瓶培养120小时后总MK-7产量为64.86 mg/L，较对照提高22.22%，且胞内MK-7占比由42.80%升至68.77%。总抗氧化能力（T-AOC）达1.65 U/mg，为原始菌株的6.51倍，NADH/NAD+比值亦显著升高。该工作首次将ALE应用于枯草芽孢杆菌维生素K耐受性改良，证实了该策略对MK-7发酵生产的促进作用，为其他VK2亚型的微生物生产提供了理论基础，进化菌株BS012亦有望应用于益生菌制剂开发。
创新点
['首次利用ALE技术提高枯草芽孢杆菌对维生素K的耐受性，将VK3耐受浓度从6.0 mg/L提升至60.0 mg/L。', '进化菌株BS012在静态和摇瓶培养中MK-7产量分别比原始菌株提高76%和22.22%。', '结合基因组重测序和转录组分析，系统揭示了细胞形态、抗氧化系统、碳/氮代谢、孢子形成等多层面的耐受机制。']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis BS011 | 维生素K耐受性进化 | — | — | 调控 | 起始菌株，经ALE进化后获得BS012，VK3耐受浓度由6.0 mg/L提高至60.0 mg/L |
| Bacillus subtilis BS012 | MK-7生物合成 | — | — | 催化 | 进化菌株，在摇瓶培养中MK-7产量为64.86 mg/L，较BS011提高22.22% |
| Bacillus subtilis BS012 | 生物膜形成/胞外多糖合成 | epsC, epsB, sinR | EpsC, EpsB, SinR | 区室化 | 基因组突变导致形成褶皱生物膜，静态培养生物膜生物量达11.29 g/L，比BS011高约2.7倍 |
| Bacillus subtilis BS012 | 细胞壁重塑与细胞分裂调控 | walK | WalK（两组分传感器激酶） | 调控 | 突变导致细胞长度增加近两倍，降低比表面积以减少VK3侵入 |
| Bacillus subtilis BS012 | 中心碳代谢（TCA循环） | pdhABCD, odhAB, pcKA, mmgD | 丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶等 | 催化 | 相关基因下调，减少呼吸链ROS产生，碳代谢通量降低 |
| Bacillus subtilis BS012 | 铁代谢 | dhbACE, feuABC, fhuBCGD, ykuNOP, mrgA | 铁载体合成及摄取相关蛋白 | 转运 | 铁载体合成和摄取基因下调，降低细胞内铁浓度以减少ROS产生 |
| Bacillus subtilis BS012 | 厌氧硝酸盐呼吸 | narGHJI, nasD, nasE | 硝酸还原酶Nar、亚硝酸还原酶 | 能量供给 | narGHJI操纵子上调（log2变化2.40-3.00），以硝酸盐呼吸维持能量代谢，减少需氧呼吸产生的ROS |
| Bacillus subtilis BS012 | 孢子形成与抗氧化防御 | spoVAA, spoVAC, sleB, stoA, sqhC, sspA, ykoV | SpoVA、SleB、StoA、SqhC、SspA、YkoV | 区室化 | 孢子形成基因提前激活，孢子结构及保护蛋白增强对VK3氧化胁迫的抵抗 |
| Bacillus subtilis BS012 | 全局代谢调控 | fnr, ccpA, codY, sigB, sigM, sigV | Fnr, CcpA, CodY, SigB, SigM, SigV | 调控 | 转录因子表达变化协调碳氮代谢、厌氧呼吸和压力响应 |
关键发现
- BS012对VK3的耐受浓度从6.0 mg/L提高到60.0 mg/L
- 在静态培养中，BS012生物膜生物量达11.29 g/L（BS011为4.17 g/L），生物膜中MK-7含量为1.51 μg/mg，比BS011提高75.71%
- 摇瓶培养120 h后总MK-7产量达64.86 mg/L，比BS011提高22.22%，其中胞内MK-7占68.77%（BS011为42.80%）
- BS012的T-AOC为1.65 U/mg，是BS011的6.51倍
- 细胞长度约为BS011的两倍
- NADH/NAD+比值在BS012中为1.64，BS011为0.88
- BS012的ΔΨ（红/绿荧光比值）为1.2712，与BS011的1.2619无显著差异。
研究结论
ALE技术能显著增强枯草芽孢杆菌对维生素K的耐受性并提高MK-7产量，为其他VK2亚型的微生物发酵生产提供了理论依据；进化菌株BS012有望作为益生菌制剂用于维持肠道菌群稳态、缓解骨质疏松和降低心血管疾病风险。