Regulation of a novel DsGATA1 from Dunaliella salina on the synthesis of carotenoids under red light
- 作者
- Yao Song, Yanhong Lan, Ke Li, Dairong Qiao, Yi Cao, Hui Xu
- 单位
- Microbiology and Metabolic Engineering Key Laboratory of Sichuan Province, Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment of Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan, People's Republic of China
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-023-12894-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
红光照条件下盐生杜氏藻（Dunaliella salina）中类胡萝卜素合成的调控机制尚不清楚；本研究旨在解析新型转录因子DsGATA1在红光下调控类胡萝卜素合成的分子机制。
研究策略
从杜氏盐藻中鉴定出结构独特的GATA转录因子DsGATA1；构建DsGATA1过表达和干扰转基因藻株；通过生理生化测定、转录组分析、qRT-PCR、酵母单杂交等技术，比较不同基因型在红光下的生长、类胡萝卜素含量、氮代谢相关基因表达及NO含量，并利用NO清除剂验证NO对类胡萝卜素合成的影响。
研究路线图
核心内容
本研究从盐生杜氏藻中鉴定出结构独特的GATA转录因子DsGATA1，其进化上接近动物源GATA但识别植物GATA基序。通过构建过表达和干扰转基因藻株，结合生理生化测定、转录组分析、qRT-PCR和酵母单杂交等手段，解析了红光下DsGATA1调控类胡萝卜素合成的分子机制。研究发现DsGATA1作为全局正调控因子，一方面直接结合类胡萝卜素合成途径关键酶基因PSY、ZDS、CRTISO的启动子并上调其表达，另一方面结合硝酸还原酶（NR）启动子激活其表达，促进硝酸盐吸收和氮代谢，过表达株第五天培养基硝酸盐残留仅为野生型的70%。值得注意的是，NR激活产生的NO积累对类胡萝卜素合成具有抑制作用，过表达株NO含量达野生型的3倍。添加NO清除剂cPtIO解除抑制后，过表达株总类胡萝卜素产量比未添加时提高1.1倍，最终使红光下类胡萝卜素产量较野生型提高46%。该研究揭示了DsGATA1介导的氮代谢与类胡萝卜素合成之间的调控网络，为杜氏盐藻类胡萝卜素生产工程改造提供了重要靶点。
创新点
发现DsGATA1在进化上接近动物源GATA但识别植物GATA基序，结构独特；揭示DsGATA1作为全局调控因子，通过直接结合硝酸还原酶（NR）启动子激活其表达，促进氮代谢，同时上调CBP途径关键基因（PSY、ZDS、CRTISO）来促进类胡萝卜素合成；首次证明DsGATA1介导的NO积累抑制类胡萝卜素合成，并提出过表达DsGATA1联合添加NO清除剂可使红光下类胡萝卜素产量提高46%。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 类胡萝卜素合成途径 (CBP) | DsGATA1 | DsGATA1 | 调控 | GATA转录因子，响应红光，全局调控类胡萝卜素合成和氮代谢 |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 类胡萝卜素合成途径 (CBP) | PSY | Phytoene synthase | 催化 | 过表达DsGATA1后表达上调1.4倍，干扰株为91% |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 类胡萝卜素合成途径 (CBP) | ZDS | Zeta-carotene desaturase | 催化 | 过表达DsGATA1后表达上调1.3倍，干扰株为94% |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 类胡萝卜素合成途径 (CBP) | CRTISO | Carotenoid isomerase | 催化 | 过表达DsGATA1后表达上调1.1倍，干扰株为84% |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 氮代谢途径 | NR | Nitrate reductase | 催化 | DsGATA1直接结合其启动子并激活转录；过表达株中表达增加30%，干扰株为85% |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 氮代谢途径 | GOGAT | Glutamate synthase | 催化 | 过表达株中表达增加27%，干扰株为90% |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 氮代谢途径 | GDH | Glutamate dehydrogenase | 催化 | 过表达株中表达增加48%，干扰株为90% |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 氮代谢途径 | GS | Glutamine synthetase | 催化 | 过表达株中表达略有增加 |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 氮代谢途径 | NRT | Nitrate transporter | 转运 | 过表达株中表达略有增加 |
| Dunaliella salina (盐生杜氏藻) | 氮代谢途径 | AMT | Ammonium transporter | 转运 | 过表达株中表达增加36% |
关键发现
- DsGATA1基因CDS长1080 bp，编码360个氨基酸。过表达株OE1、OE2、OE3中DsGATA1表达量分别为野生型的6.3、2.3、3.6倍
- 干扰株I1、I2、I3分别为野生型的86%、61%、35%。红光下野生型生物量比白光增加2.8×10^6 cell/mL，OE1增加3.0×10^6 cell/mL，I3增加2.0×10^6 cell/mL。红光下野生型叶绿素含量比白光增加33%，OE1增加53%。第四天，过表达株（OE2）类胡萝卜素含量在红光和白光下分别比野生型提高19.4%和18.6%
- 干扰株I3在红光下仅为野生型的71.5%，白光下减少34%。红光下类胡萝卜素产量比白光：OE1提高46%，野生型提高45%，I3提高37%。第三天，过表达株总类胡萝卜素产量为1.12 mg/mL，比野生型高25%，生物量高15%
- 干扰株总产量和生物量分别为野生型的69%和74%。第四天，过表达株单细胞类胡萝卜素产量为野生型的1.2倍，干扰株约为野生型的87%
- 过表达株总产量增加40%，干扰株总产量减少28%
- 过表达株叶黄素和β-胡萝卜素含量分别增加9%和25%，干扰株分别减少4%和9%。第五天，过表达株单细胞产量为野生型的1.1倍，干扰株为90%。基因表达分析显示，过表达株中PSY、ZDS、CRTISO表达分别为野生型的1.4、1.3、1.1倍，干扰株分别为91%、94%、84%
- 氮代谢基因NR、GOGAT、GDH表达分别增加30%、27%、48%，AMT表达增加36%
- 干扰株中NR、GOGAT、GDH表达分别为野生型的85%、90%、90%。硝酸盐消耗测定显示，第五天过表达株培养基中硝酸盐残留仅为野生型的70%，干扰株为野生型的1.2倍。NO含量测定显示，过表达株NO含量为野生型的3倍，干扰株为野生型的40%。添加NO清除剂cPtIO后，过表达株、野生型和干扰株NO含量分别下降27%、16%和8%
- 过表达株总类胡萝卜素产量比未添加时提高1.1倍，比野生型总产量高1.46倍
- 野生型和干扰株总产量分别提高11%和12%。最终，过表达DsGATA1并添加NO清除剂使红光下类胡萝卜素产量比野生型提高46%。
研究结论
DsGATA1是红光下杜氏盐藻类胡萝卜素合成的全局正调控因子。它一方面直接上调CBP途径关键酶基因（PSY、ZDS、CRTISO），促进类胡萝卜素合成；另一方面通过直接结合硝酸还原酶（NR）启动子激活其表达，促进硝酸盐吸收和生物量积累，同时上调GOGAT、GDH和AMT等基因维持氨稳态。但NR激活产生的NO对类胡萝卜素合成具有抑制作用，使用NO清除剂去除NO可解除抑制，使过表达株类胡萝卜素产量进一步提高。DsGATA1可作为工程改造杜氏盐藻类胡萝卜素生产的重要靶点。