Analysis of substrate specificity of cytochrome P450 monooxygenases involved in trichothecene toxin biosynthesis
- 作者
- Rosa E. Cardoza, Susan P. McCormick, Natalia Martinez-Reyes, Joaquín Rodríguez-Fernández, Mark Busman, Robert H. Proctor, Santiago Gutiérrez
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-023-12950-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
评估 trichothecene 生物合成中的细胞色素 P450 单加氧酶（TRI11、TRI13、TRI22）是否能够修饰非其来源物种产生的生物合成中间体，以解析其底物特异性的宽严程度。
研究策略
采用突变体互补-异源表达分析：分别在 Trichoderma arundinaceum 的 tri22 缺失突变体和 Fusarium sporotrichioides 的 tri13 缺失突变体中表达来自不同真菌的 tri11/tri13/tri22 同源基因，并结合代谢物检测（HPLC/GC-MS）和底物饲喂实验评估催化活性。
研究路线图
核心内容
该研究系统比较了单端孢霉烯毒素生物合成中三个细胞色素P450单加氧酶（TRI11、TRI13、TRI22）的底物特异性。作者通过突变体互补和异源表达策略，分别在Trichoderma arundinaceum的Δtri22突变体和Fusarium sporotrichioides的Δtri13突变体中表达来自不同真菌的同源基因，结合代谢物检测和底物饲喂实验评估催化活性。结果显示，野生型T. arundinaceum产生哈茨烷A（HA）246.55 μg/mL，而Δtri22突变体仅产生1.52 μg/mL（0.6%）；用自身tri22互补后HA恢复至约50%，用P. roridum的tri22互补后恢复至约40%，但F. sporotrichioides的tri13和Fusarium的tri11均无法互补。值得注意的是，F. graminearum的TRI11能将外源isotrichodermin约100%转化为15-decalonectrin，表明TRI11具有底物滥性，而TRI13和TRI22底物严格。此外，Δtri22突变体首次产生sambucinol和deoxysambucinol，且对立枯丝核菌的抗真菌活性降低约50%。该研究揭示了C-3位氧取代是影响底物识别的关键结构特征，增进了对真菌毒素生物合成酶功能进化的理解。
创新点
首次系统比较了亲缘关系远近不同的 trichothecene 生物合成 P450 的底物特异性；发现 TRI11 具有底物滥性，能羟化非其来源物种的中间体；揭示 C-3 位氧取代对底物识别的影响；发现 tri22 缺失导致 T. arundinaceum 产生此前未检测到的 sambucinol 和 deoxysambucinol。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Trichoderma arundinaceum IBT 40837 | trichothecene生物合成（harzianum A） | tri22 | TRI22 | 催化 | 催化EPT的C-4羟基化生成trichodermol；缺失导致HA产量降至野生型的0.6% |
| Fusarium sporotrichioides NRRL 3299 | trichothecene生物合成（T-2 toxin） | tri13 | TRI13 | 催化 | 催化calonectrin的C-4羟基化生成3,15-二乙酰基蛇形菌素；不能利用EPT为底物 |
| Paramyrothecium roridum NRRL 2183 | trichothecene生物合成 | tri22 | TRI22 | 催化 | 远缘TRI22同源蛋白，与T. arundinaceum TRI22功能保守，可互补Δtri22突变体 |
| Fusarium graminearum PH-1 | trichothecene生物合成 | tri11 | TRI11 | 催化 | 催化isothiochermin的C-15羟基化；具有底物滥性，可修饰非其来源物种产生的中间体 |
| Fusarium longipes NRRL 20695 | trichothecene生物合成 | tri11 | TRI11 | 催化 | TRI11同源蛋白，在T. arundinaceum Δtri22背景下不能互补HA产生 |
关键发现
- 野生型 T. arundinaceum 产生 HA
- 55±8.39 μg/mL；Δtri22 突变体仅产生
- 52±0.88 μg/mL（0.6%）。用 T. arundinaceum 自身 tri22 互补后 HA 恢复至
- 92-134.51 μg/mL（50.7%-54.5%）；用 P. roridum tri22 互补后约
- 19 μg/mL（40.6%）。F. sporotrichioides tri13 和 F. graminearum/F. longipes tri11 均不能互补 Δtri22 突变体，HA 水平仍为野生型的
- 5%-1.4%。P. roridum tri22 同样不能恢复 F. sporotrichioides Δtri13 突变体产生 T-2 毒素的能力，转化株仍产生 4-deoxy T-2 toxin。但在 T. arundinaceum Δtri22 转化株中表达的 F. graminearum TRI11 能将外源 isothiochermin 约100%转化为 15-decalonectrin，表明 TRI11 可修饰非其来源物种的中间体；TRI13 和 TRI22 则不能利用对方来源的底物。此外，Δtri22 突变体产生 EPT、aspinolides、sambucinol 和 deoxysambucinol，其中后两种为首次在该物种中检测到；tri22 缺失使对 Rhizoctonia solani 的抗真菌活性降低约50%。
研究结论
Trichothecene 生物合成 P450 的底物专一性存在差异：TRI13 与 TRI22 底物严格，TRI11 底物滥性；EPT 的 C-3 位是否含氧原子可能是影响底物识别的关键结构特征。该研究增进了对真菌毒素生物合成酶功能进化的理解。