Discovery and biochemical characterization of thermostable glycerol oxidases
- 作者
- Lars L. Santema, Laura Rotilio, Ruite Xiang, Gwen Tjallinks, Victor Guallar, Andrea Mattevi, Marco W. Fraaije
- 单位
- Molecular Enzymology, University of Groningen, Nijenborgh 4, 9747AG, Groningen, The Netherlands; Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia, via Ferrata 9, 27100 Pavia, Italy; Barcelona Supercomputing Center (BSC), Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats (ICREA), Barcelona 08034, Spain
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-023-12883-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
快速发现能够高效氧化甘油且具有良好热稳定性的醛醇氧化酶，并对其进行生化与结构表征，以扩展用于甘油增值转化的生物催化剂工具箱。
研究策略
整合计算机模拟（AlphaFold结构预测与PELE分子模拟）与无细胞蛋白合成（NEBExpress细胞-free体系）及活性筛选，结合生化表征、晶体结构解析和理性突变设计，快速发现并改造甘油氧化酶。
核心内容
本研究建立了一套整合计算机模拟与无细胞蛋白合成的高效酶发现流程，用于快速挖掘和改造热稳定的甘油氧化酶。作者首先利用AlphaFold结构预测和PELE分子模拟对候选醛醇氧化酶进行虚拟筛选，再通过NEBExpress无细胞表达系统快速合成并表征候选酶，最终从嗜热菌基因组中鉴定出三种新型热稳定甘油氧化酶AldO_Ab、AldO_Ch和AldO_St。生化表征显示，这些酶在pH 7.5下的熔解温度分别为82°C、78°C和85°C，均高于已报道的同类酶。作者还解析了AldO_Ab与D-木酮糖复合物的晶体结构（2.4 Å分辨率），揭示了FAD辅因子通过His45共价结合及长约14 Å、宽约10 Å的活性位点隧道。基于结构信息，对来自T. flexuosa的AldO_Tf进行理性突变设计，获得V258L_P259I双突变体，其催化效率kcat/KM从32 M⁻¹ s⁻¹提高到98 M⁻¹ s⁻¹，提升约3倍，同时熔解温度从76°C升至81°C。该研究提供了一种从序列到功能验证的一体化酶发现策略，获得的耐热甘油氧化酶在甘油选择性氧化为D-甘油酸等高附加值产品方面具有应用潜力。
创新点
建立了从基因组挖掘到无细胞表达筛选的一体化酶发现流程；利用PELE诱导契合模拟指导双突变（V258L_P259I）设计，使AldO_Tf对甘油的催化效率提高约3倍且热稳定性提高5°C；解析了AldO_Ab与D-木酮糖复合物的晶体结构（2.4 Å），揭示了底物结合与催化隧道。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli NEB10-β | 甘油氧化 | — | AldO_Tf (来自Thermopolyspora flexuosa的醛醇氧化酶) | 催化 | 作为基准酶，重组表达产量300 mg/L，熔解温度76°C，甘油氧化kcat/KM=32 M-1 s-1 |
| Escherichia coli NEB10-β | 甘油氧化 | — | AldO_Ab (来自Actinobacteria Bacterium的醛醇氧化酶) | 催化 | 新发现的酶，晶体结构解析至2.4 Å，甘油氧化kcat/KM=14 M-1 s-1，熔解温度82°C，表达产量72 mg/L |
| Escherichia coli NEB10-β | 甘油氧化 | — | AldO_Ch (来自Thermostaphylospora chromogena的醛醇氧化酶) | 催化 | 新发现的酶，甘油氧化kcat/KM=14 M-1 s-1，熔解温度78°C，表达产量30 mg/L |
| Escherichia coli NEB10-β | 甘油氧化 | — | AldO_St (来自Streptomyces thermoviolaceus的醛醇氧化酶) | 催化 | 新发现的酶，最耐热（熔解温度85°C），甘油动力学参数见原文，表达产量71 mg/L |
| Escherichia coli NEB10-β | 甘油氧化 | — | AldO_Tf V258L_P259I双突变体 | 催化 | 通过PELE模拟指导设计，甘油氧化kcat/KM提高到98 M-1 s-1，热稳定性提高5°C至81°C |
| 无细胞表达系统（NEBExpress® Cell-free E. coli Protein Synthesis System） | 甘油氧化（酶筛选） | — | 各种醛醇氧化酶候选 | 催化 | 用于快速表达和活性验证，通过HRP-AAP/DCHBS法检测H2O2生成 |
| — | 甘油氧化 | alditol oxidase基因（来自Thermopolyspora flexuosa、Actinobacteria Bacterium、Thermostaphylospora chromogena、Streptomyces thermoviolaceus） | — | 催化 | 经密码子优化后克隆至His-SUMO-pET28a和pBAD载体 |
关键发现
- 从嗜热菌基因组中筛选出三种新的热稳定醛醇氧化酶（AldO_Ab、AldO_Ch、AldO_St），其对甘油的催化效率（kcat/KM）分别为14、14和4.6 M-1 s-1（此处表格中AldO_St数据未完整列出，但文中提到其kcat最高）
- 所有新酶熔解温度在pH 7.5时分别为82°C、78°C和85°C，均高于75°C
- AldO_Ab晶体结构解析至2.4 Å分辨率，FAD通过His45 Nδ1共价结合，活性位点隧道长约14 Å、宽约10 Å
- 对T. flexuosa来源的AldO_Tf进行定点突变，获得V258L_P259I双突变体，其kcat从1.6 s-1提高到4.0 s-1，KM从50 mM降至41 mM，kcat/KM从32 M-1 s-1提高到98 M-1 s-1（提升约3倍），同时熔解温度从76°C升至81°C
- 重组表达产量方面，AldO_Tf为300 mg/L，AldO_Ab为72 mg/L，AldO_Ch为30 mg/L，AldO_St为71 mg/L。
研究结论
本研究开发了一种结合计算机模拟与无细胞表达的高效酶发现流程，成功鉴定出三种新的热稳定甘油氧化酶，并通过理性突变进一步提升了AldO_Tf的甘油氧化活性和热稳定性，这些酶在甘油选择性氧化为高附加值产品（如D-甘油酸）方面具有应用潜力。