Engineering amino acid residues of pentacyclic triterpene synthases for improving the activity
- 作者
- Hao Guo, Tongtong Chen, Hanrong Zhu, Huiyan Wang, Yi-Xin Huo
- 单位
- Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Science, Beijing Institute of Technology, No. 5 South Zhongguancun Street, Beijing 100081, China; Beijing Institute of Technology (Tangshan), Translational Research Center, Hebei, China
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-024-13030-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
典型五环三萜合酶（PTSs）催化活性低，导致五环三萜类化合物微生物产量受限，缺乏通用的提高PTSs活性的策略。
研究策略
通过定点饱和突变，对典型PTSs的MXXXXR基序中的非活性位点氨基酸（如Met、Cys）进行改造，以稳定baccharinyl阳离子中间体，提高催化活性。
核心内容
本研究针对五环三萜合酶催化活性低导致微生物产量受限的问题，提出了一种通用改造策略。作者以酿酒酵母SP1为底盘，对三种典型五环三萜合酶（羽扇醇合酶OEW、β-香树脂醇合酶GgbAS和α-香树脂醇合酶MdOSC1）的MXXXXR基序中非活性位点氨基酸进行定点饱和突变，旨在稳定baccharinyl阳离子中间体以提高催化活性。结果表明，该策略显著提升了三种酶的活性：OEW的M255L突变株羽扇醇产量约50 mg/L（14 mg/g生物量），较野生型提高2.7倍；GgbAS的C258V突变株β-香树脂醇产量达51.6 mg/L，活性提升最高达7.3倍；MdOSC1的M256I突变株α-香树脂醇产量约14 mg/L，提高2.4倍并改变了产物比例。该研究首次提出针对MXXXXR基序非活性位点的通用改造方案，可广泛应用于典型五环三萜合酶，为五环三萜化合物的微生物高效生产提供了新途径。
创新点
首次提出针对MXXXXR基序非活性位点的通用策略，可应用于典型五环三萜合酶（羽扇醇合酶、β-香树脂醇合酶、α-香树脂醇合酶），显著提高其活性（最高达7.3倍）。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae SP1 | 五环三萜生物合成（lupane型） | OEW | 羽扇醇合酶（lupeol synthase） | 催化 | 来源于Olea europaea，MXXXXR基序非活性位点Met255/Cys257/Cys259经饱和突变提高活性 |
| Saccharomyces cerevisiae SP1 | 五环三萜生物合成（oleanane型） | GgbAS | β-香树脂醇合酶（β-amyrin synthase） | 催化 | 来源于Glycyrrhiza glabra，非活性位点Met256/Cys258/Cys260突变显著提高β-香树脂醇产量 |
| Saccharomyces cerevisiae SP1 | 五环三萜生物合成（ursane型及oleanane型） | MdOSC1 | α-香树脂醇合酶（multifunctional α-amyrin synthase） | 催化 | 来源于Malus × domestica，非活性位点Met256/Cys258/Cys260突变改变活性及α/β-香树脂醇比例 |
关键发现
- 通过定点饱和突变MXXXXR基序中的非活性位点，成功提高了三种典型PTSs的活性。羽扇醇合酶OEW的M255L突变株产羽扇醇约50 mg/L（14 mg/g生物量），较野生型提高2.7倍和2.3倍
- C259A突变株产65 mg/L（15.5 mg/g），提高3.5倍。β-香树脂醇合酶GgbAS的M256Q突变株产β-香树脂醇45.2 mg/L（10 mg/g），提高6.5倍和5.9倍
- C258V突变株产51.6 mg/L，提高7.3倍
- C258A产48.2 mg/L（6.8倍），C258S产33.3 mg/L（4.7倍）
- C260W产30.6 mg/L（4.4倍）。α-香树脂醇合酶MdOSC1的M256I突变株产α-香树脂醇约14 mg/L和β-香树脂醇4.2 mg/L，分别提高2.4倍和1.8倍，且改变了α/β比例。组合突变中，OEW M255Y/C259G使羽扇醇产量达35 mg/L，较野生型提高1.9倍
- GgbAS M256A/C258V/C260W使β-香树脂醇达12.8 mg/L，提高1.55倍。整体上活性最高提升达7.3倍。
研究结论
研究表明，改造MXXXXR基序中的非活性位点可显著提高典型五环三萜合酶的催化活性，是一种通用策略，为五环三萜类化合物的微生物生产提供了新途径。