Identification and monitoring of cell heterogeneity from plasmid recombination during limonene production
- 作者
- Lucas Gelain, Jing Wui Yeoh, Gazi Sakir Hossain, Sandrine Alfenore, Stéphane Guillouet, Hua Ling, Chueh Loo Poh, Nathalie Gorret, Jee Loon Foo
- 单位
- CNRS@CREATE, 1 Create Way, Create Tower, Dover 138602, Singapore; NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), National University of Singapore, Kent Ridge 117456, Singapore; Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, Kent Ridge 117583, Singapore; TBI, Université de Toulouse, CNRS, INRAE, INSA, Toulouse, France; Synthetic Biology Translational Research Programme, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Kent Ridge, Singapore; Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Kent Ridge, Singapore; National Centre for Engineering Biology (NCEB), Kent Ridge, Singapore
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2025）
- DOI
- 10.1007/s00253-024-13273-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
传统分子生物学方法（如菌落PCR、限制酶切）检测质粒结构变化费时费力，无法实时监测生物生产过程中由质粒重组引起的细胞异质性。
研究策略
将GFP报告基因插入质粒pJBEI-6409关键酶基因（柠檬烯合酶）下游，结合流式细胞术、荧光激活细胞分选（FACS）和机理建模，实时监测和定量不同质粒结构的细胞亚群，并关联细胞异质性与柠檬烯生产性能。
研究路线图
核心内容
本研究针对传统分子生物学方法在检测质粒重组引起的细胞异质性时操作繁琐、无法实时监测的问题，在大肠杆菌MG1655生产柠檬烯的质粒pJBEI-6409关键酶基因下游插入GFP报告基因，结合流式细胞术、荧光激活细胞分选和机理建模，实现了对质粒重组的实时监测与细胞亚群定量。研究发现可在10和50 μM IPTG条件下区分-GFP、+GFP和++GFP三种亚群，其中10 μM IPTG时柠檬烯产量最高达530 mg/L，不正确质粒亚群比例仅12%，而50 μM IPTG时产量仅96 mg/L，不正确质粒亚群占比超过70%。FACS分离验证了R1和R2两个重组区域：-GFP亚群丢失下游6个酶及GFP基因，++GFP亚群丢失四个中间酶。模型与实验结合显示Pearson相关系数r=0.47，排除离群点后升至0.78，Hill方程拟合R²=0.95，且GFP荧光强度与柠檬烯产量呈正相关。该方法可推广至其他生物过程，用于监测遗传回路不稳定性和优化生产。
创新点
['在质粒关键酶下游插入GFP报告基因，实现质粒重组的实时监测与细胞异质性可视化', '利用流式细胞术和FACS识别并分离携带不同质粒结构的三种亚群（-GFP、+GFP、++GFP），避免传统分子生物学分析的繁琐步骤', '结合机理建模提出质粒重组区域（R1和R2）的假设，并通过实验验证重组事件', '发现柠檬烯产量与GFP荧光强度正相关，可作为生物传感器的替代方案用于高通量筛选']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | atoB | 乙酰乙酰辅酶A合酶 | 催化 | 参与甲羟戊酸途径第一步反应 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | HMGS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | HMGR | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 将HMG-CoA还原为甲羟戊酸 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | MK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 磷酸化甲羟戊酸 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 进一步磷酸化甲羟戊酸磷酸 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | PMD | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 脱羧生成异戊烯基焦磷酸（IPP） |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP异构化 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | GPPS | 香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成GPP |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | LS | 柠檬烯合酶 | 催化 | 催化GPP环化生成柠檬烯，是途径瓶颈酶之一 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲羟戊酸途径与柠檬烯合成 | GFP | mGFPmut2 | 调控 | 报告基因，插入LS下游，用于监测质粒重组和基因表达动态 |
关键发现
- 通过流式细胞术可在10和50 μM IPTG条件下区分三种GFP亚群（-GFP、+GFP、++GFP）。在100 mL培养中，10 μM IPTG时柠檬烯产量最高达530 mg/L，携带不正确质粒的亚群比例仅12%
- 50 μM IPTG时产量仅96 mg/L，不正确质粒亚群占比超过70%。FACS分离验证：-GFP亚群质粒在R2区域重组（丢失6个下游酶及GFP基因），50 μM下++GFP亚群在R1区域重组（丢失MK、PMK、PMD、idi四个中间酶）。培养条件对比中，LB接种含葡萄糖时-GFP亚群比例在48h为15%，无葡萄糖时接近50%，MM接种时约40%。50 μM IPTG诱导下，++GFP亚群比例在8h达到76%后骤降至96h约6%，同时-GFP亚群升至约70%。模型与实验结合：Pearson相关系数r=0.47（含离群点），排除离群点后r=0.78，Hill方程拟合R²=0.95。乙酸积累最高约4 g/L，接近抑制浓度。GFP荧光强度与柠檬烯产量呈正相关。
研究结论
本研究开发了一种结合流式细胞术、FACS和机理建模的方法，可快速鉴定单细胞水平的质粒重组，并将细胞异质性与柠檬烯生物生产性能关联起来。该方法可推广至其他生物生产过程，用于监测遗传回路不稳定性及优化生产。