Biochemical characterization of a multiple prenyltransferase from Tolypocladium inflatum
- 作者
- Haiyan Han, Shuang Peng, Qian Wang, Hongwei Wang, Pengchao Wang, Chang Li, Jianzhao Qi, Chengwei Liu
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-024-13113-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析 Tolypocladium inflatum 中一个多重异戊烯基转移酶 TolF 的功能及其底物特异性，揭示吲哚二萜类化合物异戊烯基化的分子基础和产物多样性。
研究策略
通过基因组信息学分析发现 tol 基因簇，在米曲霉中异源表达 tolF 和 terF，结合底物饲喂（paxilline、β-paxitriol、terpendole I）进行体内转化，并利用纯化的重组酶进行体外酶活分析，通过 LC-MS 和 NMR 鉴定产物结构。
研究路线图
核心内容
该研究通过基因组信息学分析在 Tolypocladium inflatum 中发现了吲哚二萜生物合成基因簇 tol，并在米曲霉中异源表达了其中的异戊烯基转移酶基因 tolF，同时借助底物饲喂和体外酶活实验系统解析了 TolF 的功能。结果表明，TolF 能催化 paxilline 的 20 位和 22 位异戊烯基化，分别生成 [M+H]+ 为 504.3105 和 504.3106 的产物，较底物（m/z 436）增加了 68 Da；对 β-paxitriol 的转化产生两种产物（[M+H]+ 均为 506.3），而对 terpendole I 仅生成单一产物。体外实验证实 TolF 与同源酶 TerF 均具有广谱底物耐受性，但 terpendole I 几乎被完全消耗，而 paxilline 和 β-paxitriol 有残留，提示 terpendole I 是天然底物。此外，tol 基因簇与 ter 基因簇相关基因高度同源（TolF 与 TerF 同一性 74%）。该工作首次表征了 TolF 为多重异戊烯基转移酶，阐明了吲哚二萜异戊烯基化的分子基础，为通过改变异戊烯基转移酶的区域选择性来合成新型生物活性化合物提供了思路。
创新点
首次表征 TolF 为可催化 paxilline 20 和 22 位异戊烯基化的多重异戊烯基转移酶；证明 TolF 与 TerF 均具有广谱底物耐受性，且 terpendole I 是天然底物；为真菌吲哚二萜异戊烯基转移酶区域选择性改变及合成生物活性化合物提供新思路。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Tolypocladium inflatum CICC-2598 | 吲哚二萜生物合成（tol 基因簇） | tolF | TolF | 催化 | 多重异戊烯基转移酶，催化 paxilline 20/22 位、β-paxitriol 20/22 位及 terpendole I 的异戊烯基化 |
| Chaunopycnis alba | 吲哚二萜生物合成（terpendole，ter 基因簇） | terF | TerF | 催化 | 与 TolF 同源（74% 同一性），底物耐受性和区域选择性相似 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 异源表达宿主 | tolF | TolF | 催化 | 构建 AO-tolF 菌株用于体内功能分析（饲喂底物） |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 异源表达宿主 | terF | TerF | 催化 | 构建 AO-terF 菌株用于体内功能分析（饲喂底物） |
| Escherichia coli BL21 | 蛋白表达宿主 | tolF | TolF | 催化 | 利用 pMAL-c5x 载体表达重组 TolF 用于体外酶活实验 |
| Escherichia coli BL21 | 蛋白表达宿主 | terF | TerF | 催化 | 表达重组 TerF 用于体外酶活实验 |
关键发现
- TolF 在 A. oryzae 中异源表达并饲喂 paxilline（1）时产生 20-异戊烯基paxilline（5）和 22-异戊烯基paxilline（10），两者分子式均为 C32H41NO4，[M+H]+ 分别为
- 3105 和
- 3106，比底物 1（m/z 436）大 68 Da；饲喂 β-paxitriol（13）产生 14 和 15，[M+H]+ 分别为
- 3264 和
- 3262（C32H43NO4），并检测到特征碎片
- 13；饲喂 terpendole I（11）仅产生单一产物 12。体外酶活实验证实 TolF 和 TerF 均能催化
- 13、11 的异戊烯基化，且 11 几乎完全消耗而 1 和 13 有残留，表明天然底物为 11。tol 基因簇中 tolCMB 与 terCMB 氨基酸同一性至少 58%，TolF 与 TerF 同一性为 74%，tolPQ 与 terPQ 同一性分别为 80% 和 73%。纯化的重组 TolF 表观分子量约 47 kDa。
研究结论
本研究表征了 T. inflatum 中的多重异戊烯基转移酶 TolF，其与同源酶 TerF 均能对 paxilline、β-paxitriol 和 terpendole I 进行异戊烯基化，且 terpendole I 是天然底物。该工作加深了对吲哚二萜异戊烯基化反应分子基础的理解，提示真菌异戊烯基转移酶可通过改变位置特异性用于合成生物活性化合物，为开发新的生物合成策略和药物提供基础。