Novel glycosidase from Paenibacillus lactis 154 hydrolyzing the 28-O-β-D-glucopyranosyl ester bond of oleanane-type saponins
- 作者
- Zongzhan Wu, Wenyu Dou, Xiaolin Yang, Tengfei Niu, Zhuzhen Han, Li Yang, Rufeng Wang, Zhengtao Wang
- 单位
- Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; The SATCM Key Laboratory for New Resources and Quality Evaluation of Chinese Medicines, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-024-13109-2
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏高效制备稀有齐墩果烷型人参皂苷的方法，尤其是选择性水解C-28位葡萄糖酯键的生物催化剂。
研究策略
从Paenibacillus lactis 154中克隆新型糖苷水解酶基因P/GH3，在大肠杆菌中异源表达并纯化，系统表征酶学性质；通过分子对接解析底物特异性机制；并以竹节参总皂苷（TSPJ）为底物，利用P/GH3进行生物转化制备稀有皂苷。
研究路线图
核心内容
研究从Paenibacillus lactis 154中克隆了新型糖苷水解酶基因P/GH3，并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达和纯化。该酶由749个氨基酸组成，分子量约89.5 kDa，对pNP-β-D-Glc的最适pH为8、最适温度为50℃，在30℃、40℃和50℃下的半衰期分别为163.85、79.88和6.04小时。酶动力学显示，P/GH3对人参皂苷Ro的Km为79.59 μM，kcat为18.52 s⁻¹；对pNP-β-D-Glc的Km为22.76 μM，kcat为46.18 s⁻¹。利用分子对接解析了其底物特异性机制，证实该酶能区域选择性水解齐墩果烷型皂苷C-28位的β-D-葡萄糖酯键，而不产生齐墩果酸副产物。以0.5 g竹节参总皂苷为底物进行生物转化，成功制备了32.1 mg伪人参皂苷RP1、30 mg竹节参皂苷TVI以及ZR1和CE四种稀有皂苷。这是首次报道GH3家族酶能够特异性水解C-28位葡萄糖酯键，并首次通过生物转化获得RP1和TVI，为稀有齐墩果烷型皂苷的绿色高效制备提供了新途径。
创新点
首次报道能定向水解齐墩果烷型皂苷C-28位β-D-葡萄糖酯键的GH3家族酶P/GH3；首次通过生物转化法制备得到伪人参皂苷RP1和竹节参皂苷TVI；利用分子对接揭示了P/GH3的区域选择性机制。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 重组蛋白表达 | P/GH3 | P/GH3 | 催化 | 异源表达重组糖苷水解酶，用于皂苷生物转化 |
| Paenibacillus lactis 154 | 糖苷水解酶合成 | P/GH3 (GenBank: OR801326) | P/GH3 | 催化 | 新型糖苷水解酶来源菌株 |
关键发现
- P/GH3由749个氨基酸组成，分子量89.5 kDa。以pNP-β-D-Glc为底物时最适pH 8、最适温度50℃
- 对人参皂苷Ro的Km为79.59±3.42 μM，kcat为18.52 s^-1
- 对pNP-β-D-Glc的Km为22.76±1.33 μM，kcat为46.18 s^-1。P/GH3在30℃、40℃、50℃下半衰期分别为163.85 h、79.88 h、6.04 h。以0.5 g TSPJ为底物，经生物转化分离得到32.1 mg RP1和30 mg TVI，同时获得ZR1和CE。P/GH3特异性水解C-28位葡萄糖酯键，不产生齐墩果酸。
研究结论
本研究筛选并表征了具有特殊水解活性的GH3家族酶P/GH3，能特异性水解齐墩果烷型皂苷C-28位葡萄糖酯键。以TSPJ为底物，通过绿色高效的生物转化成功制备了四种稀有齐墩果烷型皂苷（CE、RP1、ZR1、TVI），其中RP1和TVI为首次通过生物转化获得，为稀有皂苷的制备提供了新途径。