Enzyme-constrained genome-scale model of Yarrowia lipolytica predicts growth-phase specific metabolic engineering targets
- 作者
- Juliano Sabedotti De Biaggi, Young-Kyoung Park, Eduard J. Kerkhoven, Rodrigo Ledesma-Amaro, Petri-Jaan Lahtvee
- 单位
- Department of Chemistry and Biotechnology, Tallinn University of Technology; Micalis Institute, Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech; Department of Bioengineering and Imperial College Centre for Synthetic Biology, Imperial College London
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2026）
- DOI
- 10.1007/s00253-026-13791-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有Yarrowia lipolytica的酶约束基因组规模模型（ecGEM）未采用最新深度学习kcat预测方法且尚未用于指导代谢工程；本研究旨在重建一个融合深度学习kcat约束的ecGEM，并利用其预测不同生长阶段（指数期和氮限制期）的脂质和类胡萝卜素生产菌株的代谢工程靶点。
研究策略
以经人工校正的iYali5为底模，采用GECKO 3.0及DLKcat预测kcat构建新ecGEM（ecYali5-GEM）；结合生物反应器实验测定的生理通量和基于质谱的绝对蛋白质组学数据，对多种菌株（PAR、CAR、OBE）在指数期和氮限制期分别构建蛋白质组约束的ecGEM（ecGEMprot）；利用ecFSEOF、通量控制系数和稳健性分析预测生长相特异性的代谢工程靶点。
研究路线图
核心内容
本研究以解脂耶氏酵母为底盘，基于人工校正的iYali5模型，结合GECKO 3.0框架与深度学习工具DLKcat预测的酶催化常数kcat，重建了公开可用的酶约束基因组规模模型ecYali5-GEM。随后，整合生物反应器测定的生理通量和质谱绝对蛋白质组学数据，针对产类胡萝卜素菌株CAR、产脂质菌株OBE及亲本菌株PAR在指数期和氮限制期分别构建了蛋白质组约束模型。实验测得PAR、CAR和OBE的最大比生长速率分别为0.45、0.42和0.31 h⁻¹，氮限制期OBE脂质含量达20.9%DCW，比PAR高5.1倍。模型预测揭示CAR中烯醇化酶ENO在两个生长阶段的容量利用率接近100%，构成限速瓶颈；PAR中谷氨酸脱氢酶GDH1通量比CAR和OBE分别高4.0倍和5.8倍。通过通量扫描和稳健性分析，研究还鉴定了八氢番茄红素脱氢酶等新靶点，并据此提出结合诱导型启动子的两阶段代谢工程策略，为后续DBTL循环提供了理性设计依据。
创新点
首次将深度学习预测的kcat值用于Y. lipolytica酶约束模型重建；通过整合多组学数据实现生长相特异性的工程靶点预测；提出利用诱导型启动子进行精准时期表达的工程策略；鉴定了多个未经实验验证的新靶点，并验证了部分已知靶点。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | 甲羟戊酸/类异戊二烯途径 | HMG1 | truncated HMG-CoA reductase (tHMGR, YALI0E04807g) | 催化 | 过表达以增强类胡萝卜素前体乙酰CoA池 |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素生物合成 | GGS1 | geranylgeranyl diphosphate synthase (YALI0D17050g) | 催化 | 与CarB、CarRP共表达于car-cassette中，过表达增强类胡萝卜素产量 |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素生物合成 | CarB | phytoene synthase/desaturase (异源) | 催化 | 来自car-cassette，催化八氢番茄红素合成 |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素生物合成 | CarRP | bifunctional lycopene cyclase/phytoene synthase (异源) | 催化 | 来自car-cassette，催化番茄红素环化等 |
| Yarrowia lipolytica | 甘油三酯合成 | DGA2 | diacylglycerol acyltransferase (YALI0D07986g) | 催化 | 在OBE中过表达，作为pull模块 |
| Yarrowia lipolytica | 甘油三酯合成 | GPD1 | glycerol-3-phosphate dehydrogenase | 催化 | 在OBE中过表达，增加甘油-3-磷酸供给 |
| Yarrowia lipolytica | 脂肪酸β-氧化 | POX1-6 | acyl-CoA oxidases | 催化 | 在OBE中敲除以防止脂质降解 |
| Yarrowia lipolytica | 脂质降解 | TGL4 | triacylglycerol lipase | 催化 | 在OBE中敲除以减少脂质分解 |
| Yarrowia lipolytica | 糖酵解 | ENO | enolase (YALI0F16819g) | 催化 | ecGEM预测在CAR中为限速酶，指数期和氮限制期容量利用率接近100% |
| Yarrowia lipolytica | 氮同化 | GDH1 | glutamate dehydrogenase (YALI0F17820g) | 催化 | PAR中通量显著高于CAR和OBE，可能与氮代谢调控有关 |
| Yarrowia lipolytica | 脂肪酸去饱和 | FAD2 | Δ12 fatty acid desaturase (YALI0B10153g) | 催化 | 在OBE中下调，与C18:2含量降低一致 |
| Yarrowia lipolytica | 类胡萝卜素生物合成 | phytoene dehydrogenase | phytoene dehydrogenase (推测为CarRP或CrtI类) | 催化 | ecFSEOF预测的靶点，建议用诱导型启动子在特定生长阶段表达 |
关键发现
- 实验测得PAR、CAR和OBE在甘油最小培养基（C/N=86）中的最大比生长速率分别为0.45±0.02、0.42±0.02和0.31±0.01 h^-1
- 氮限制期脂质含量分别为4.1%、9.9%和20.9%（DCW），其中OBE比PAR高5.1倍
- CAR在指数期和氮限制期的类胡萝卜素含量分别为16.6±4.3和11.6±0.8 mg/gDCW
- 蛋白质组学检测到平均4329个蛋白
- 在两种改造菌株中，麦角固醇合成相关蛋白（如YALI0B15818g、YALI0D15334g）显著下调
- ecGEM预测CAR中烯醇化酶（ENO, YALI0F16819g）在指数期和氮限制期的容量利用率分别达99.8%和100%，构成限速瓶颈
- PAR中谷氨酸脱氢酶GDH1通量为0.335 mmol·gDCW^-1·h^-1，分别比CAR和OBE高4.0倍和5.8倍
- FSEOF预测的靶点包括八氢番茄红素脱氢酶等，并提出了结合诱导型启动子的两轮代谢工程策略。
研究结论
本工作构建了公开可用的Y. lipolytica最新酶约束模型ecYali5-GEM，证明酶约束结合蛋白质组和生理数据能够显著提升模型对生长相特异性代谢行为的预测能力，所预测的工程靶点可为后续DBTL循环提供理性设计依据，有助于将Y. lipolytica开发为更高效的微生物细胞工厂。