Identifying setterterpenoids via feature-based molecular networking and small-scale fermentation
- 作者
- Kangjie Lv, Yuyang Duan, Xiaoying Li, Xinye Wang, Cuiping Xing, Keying Lan, Bin Zhu, Guoliang Zhu, Yuyang Qiu, Songwei Li, Tom Hsiang, Lixin Zhang, Lan Jiang, Xueting Liu
- 单位
- State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science of Technology; Lab of Pharmaceutical Crystal Engineering Research and Technology, East China University of Science and Technology
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-024-13299-9
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
天然产物中低丰度新化合物（尤其是微量二倍半萜类）的快速发现与鉴定，传统化学分析常忽略低产量天然产物。
研究策略
结合小规模发酵（1 g大米培养基）与基于特征的分子网络（FBMN），在异源宿主米曲霉中表达含FoFS的fus基因簇，通过FBMN锁定候选节点，再经大规模发酵分离纯化，并通过串联表达和底物饲喂阐明生物合成途径。
核心内容
本研究建立了一种将小规模发酵（1 g大米培养基）与基于特征的分子网络（FBMN）相结合的策略，用于快速发现低丰度二倍半萜类天然产物。作者在米曲霉NSAR1异源宿主中表达了来自尖孢镰刀菌FO14005的含FoFS的fus基因簇，通过FBMN对m/z 300–500范围内的356个节点进行比对，锁定候选化合物后放大发酵分离纯化，最终鉴定出四个新的二倍半萜fusoxyoridenoind A–D，产量分别为1.5、4.0、1.5和0.2 mg，均具有5/6/7/3/5环系。通过串联表达和底物饲喂实验，阐明了P450单加氧酶FusB的多位点氧化功能，负责C-17和C-24的功能化以及A的C-1和C-8羟化。活性测试显示，化合物1和4对A375黑色素瘤细胞在10 μM下的抑制率分别为33.01±0.95%和25.02±0.83%，但抗真菌和抗菌活性较弱（MIC>50 μM）。该工作展示了FBMN与小规模发酵联用在微量天然产物发现中的高效性，并为P450酶的功能挖掘提供了可行路径。
创新点
['建立FBMN与小规模发酵联用的高效策略，可快速发现微量天然产物', '从Fusarium oxysporum FO14005中鉴定出含FoFS的fus基因簇，包含P450 FusB', '表征了四个新的二倍半萜fusoxyoridenoind A-D，均具有5/6/7/3/5环系', '揭示了P450 FusB的多位点氧化功能（C-17、C-24、C-1、C-8）']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 二倍半萜生物合成 | fusC (FoFS) | FoFS (fusoxypene synthase) | 催化 | 双功能萜烯合酶，催化合成fusoxypene A (5)，具有独特的5/6/7/3/5环系 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 二倍半萜生物合成 | fusB | FusB (cytochrome P450 monooxygenase) | 催化 | 负责C-17和C-24的功能化，以及fusoxyoridenoind A的C-1和C-8羟化 |
| Aspergillus oryzae NSAR1 | 二倍半萜生物合成 | orfA | OrfA (cytochrome P450 monooxygenase homolog) | 催化 | 预测为P450，但缺少跨膜区，可能失去催化活性 |
关键发现
- 从1 g大米培养基发酵得到1.7 mg粗提物，FBMN在m/z 300-500范围内共356个节点；分离得到fusoxyoridenoind A (1
- 5 mg)、B (2
- 0 mg)、C (3
- 5 mg)、D (4
- 2 mg)；化合物分子式分别为C25H37O3（HRMS m/z
- 2751 [M-H]-）和C25H37O4（m/z
- 2699 [M-H]-）；FusB负责C-17和C-24的功能化以及fusoxyoridenoind A的C-1和C-8羟化；化合物1和4对A375黑色素瘤细胞抑制率分别为33.01±0.95%和25.02±0.83%（10 μM），对抗真菌和细菌MIC>50 μM。
研究结论
本研究建立了FBMN结合小规模发酵的策略，从异源表达菌株中快速鉴定出四个新的二倍半萜类化合物，并阐明了P450 FusB在骨架氧化修饰中的具体功能，为低丰度天然产物的发现和P450挖掘提供了高效方法。