Systematic metabolic engineering for improved synthesis of perillic acid in Candida tropicalis
- 作者
- Haiquan Yang, Jinrong Guo, Lihua Zhang, Wei Shen, Yuanyuan Xia, Xianzhong Chen
- 单位
- The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University; The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University; College of Life Science, Xinyang Normal University
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00253-024-13279-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
首次在非常规二倍体酵母热带假丝酵母中实现紫苏酸（perillic acid）的从头合成，解决以柠檬烯为底物生物转化生产紫苏酸依赖外加底物、成本高的问题。
研究策略
通过系统代谢工程改造C. tropicalis：表达截短的柠檬烯合酶基因tLS_Ms、细胞质/线粒体/过氧化物酶体区室化表达前体合成基因、过表达内源ERG20及突变体ERG20WW、发酵优化，以及异源表达细胞色素P450酶CYP7176和NADPH-细胞色素P450还原酶CPR，实现从葡萄糖从头合成紫苏酸。
核心内容
该研究首次在非常规二倍体酵母热带假丝酵母中实现紫苏酸的从头合成，摆脱了传统以柠檬烯为底物的外加依赖。研究者通过系统代谢工程，比较了截短与全长柠檬烯合酶的表达效果，发现截短酶使L-柠檬烯产量提高2.78倍；在细胞质中过表达七个甲羟戊酸前体合成基因，产量较对照提升31.7倍，优于线粒体和过氧化物酶体区室化策略。过表达内源ERG20反而抑制产量，而突变体ERG20WW在细胞质中将L-柠檬烯产量提高11.33倍，显著增强GPP前体供给。结合发酵优化，在60 g/L葡萄糖条件下L-柠檬烯最高达141.48 mg/L。进一步异源表达细胞色素P450酶CYP7176及还原酶CPR，完成柠檬烯到紫苏酸的氧化步骤，最终在5-L发酵罐中紫苏酸产量达106.69 mg/L，为摇瓶水平的13.8倍。该工作首次报道了工程微生物从葡萄糖直接合成紫苏酸，为其他单萜类化合物的微生物从头生产提供了可借鉴的代谢工程策略。
创新点
['首次在C. tropicalis中从头合成紫苏酸', '比较了截短与全长柠檬烯合酶、细胞质与区室化表达对L-柠檬烯合成的影响', '通过过表达ERG20WW突变体显著提高L-柠檬烯产量', '在5-L发酵罐中紫苏酸产量达106.69 mg/L']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Candida tropicalis | 甲羟戊酸（MVA）通路 | LS_Ms | L-柠檬烯合酶（来自Mentha spicata） | 催化 | 全长基因表达，产量低于截短版 |
| Candida tropicalis | 甲羟戊酸（MVA）通路 | tLS_Ms | 截短的L-柠檬烯合酶 | 催化 | 去除N端转运肽，提高催化效率，使L-柠檬烯产量提高2.78倍 |
| Candida tropicalis | 甲羟戊酸（MVA）通路 | ERG10, ERG13, tHMGR, ERG12, ERG18, ERG19, IDI | 乙酰-CoA酰基转移酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶等七个前体合成酶 | 催化 | 细胞质过表达使L-柠檬烯产量提高31.7倍；线粒体和过氧化物酶体表达效果较差 |
| Candida tropicalis | 萜类合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶（FPP合酶） | 催化 | 过表达导致GPP流向FPP，降低L-柠檬烯产量 |
| Candida tropicalis | 萜类合成 | ERG20WW | 突变法尼基焦磷酸合酶（F95W/N126W） | 催化 | 增强GPP合成并减弱FPP形成，细胞质中产量提高11.33倍 |
| Candida tropicalis | 紫苏酸合成 | CYP7176 | 细胞色素P450酶（来自Salvia miltiorrhiza） | 催化 | 催化L-柠檬烯氧化为紫苏酸 |
| Candida tropicalis | 紫苏酸合成 | CPR | NADPH-细胞色素P450还原酶（来自Arabidopsis thaliana） | 能量供给 | 为CYP7176提供电子 |
| Candida tropicalis | β-氧化 | POX5 | 脂酰辅酶A氧化酶 | 催化 | 作为基因敲除靶点用于基因组整合 |
| Candida tropicalis | 中心碳代谢 | gda324 | URA3基因片段（324 bp） | 调控 | 用于消除URA3标记基因，实现基因重复敲除 |
关键发现
- ['表达截短tLS_Ms使L-柠檬烯产量比全长LS_Ms提高2.78倍，达到0.26 mg/L', '细胞质过表达七个前体合成基因使L-柠檬烯产量比对照提高31.7倍，达8.17 mg/L（线粒体和过氧化物酶体表达分别为2.32和3.15 mg/L）', '过表达内源ERG20使L-柠檬烯产量降低：细胞质90.51%、过氧化物酶体23.52%、线粒体2.76%', '过表达ERG20WW突变体使L-柠檬烯产量在细胞质提高11.33倍，过氧化物酶体提高5.85倍', '60 g/L葡萄糖条件下L-柠檬烯最高产量为141.48 mg/L，比20 g/L对照提高1.40倍
- 100 g/L时降至72.10 mg/L', '在5-L发酵罐中，工程菌C. tropicalis GJR-EW-tLS-CYP-05产生紫苏酸106.69 mg/L，是摇瓶（7.19 mg/L）的13.8倍', '首次报道在工程微生物中从葡萄糖从头合成紫苏酸']
研究结论
通过系统代谢工程，在C. tropicalis中成功实现了L-柠檬烯和紫苏酸的从头合成。细胞质表达关键基因有利于L-柠檬烯生产，过表达ERG20WW突变体显著提高GPP供给，最终在5-L发酵罐中获得106.69 mg/L紫苏酸。