Protoplast Mutation and Genome Shuffling Induce the Endophytic Fungus Tubercularia sp. TF5 to Produce New Compounds
- 作者
- Mingzi Wang, Shaosong Liu, Yaoyao Li, Ren Xu, Chunhua Lu, Yuemao Shen
- 单位
- Key Laboratory of the Ministry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, Xiamen Engineering Research Center of Marine Microbial Drug Discovery, Fujian Laboratory of Pharmaceutical Engineering, School of Life Sciences, Xiamen University, 422 South Siming Road, Xiamen, Fujian 361005, People's Republic of China; Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, School of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou, Fujian 350108, People's Republic of China
- 杂志
- Current Microbiology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00284-010-9604-7
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
长期实验室培养导致内生真菌Tubercularia sp. TF5失去生产紫杉醇的能力，本研究尝试通过原生质体诱变和基因组改组重新激活其生产紫杉醇并挖掘新的天然产物。
研究策略
从Tubercularia sp. TF5菌丝体制备原生质体，利用UV和NTG诱变获得860个突变株，筛选后选取8株进行原生质体融合实现基因组改组，获得1100个改组菌株，通过TLC、MS和生物活性分析筛选目标菌株，并分离鉴定其代谢产物。
核心内容
针对长期实验室培养导致内生真菌Tubercularia sp. TF5丧失紫杉醇生产能力的问题，该研究采用原生质体诱变与基因组改组策略。首先从菌丝体制备原生质体，优化条件发现0.5% lywallzyme加0.5% cellulase水解9小时得率最高，其中lywallzyme影响最大（极差23.5×10⁴）。经UV和NTG诱变获得860个突变株，筛选8株进行基因组改组，得到1100个菌株。从突变株M-741中分离出3个新倍半萜tuberculariols A-C及1个已知二氢异香豆素；从改组菌株G-444中获得18个化合物，含5个新倍半萜、2个新二氢异香豆素和1个新tetralone。紫杉醇在所有菌株中均未检出，但TF5和G-444在紫杉醇浓度低于30 μg/ml时可正常生长。结果表明该策略能有效激活沉默次级代谢通路并产生新化合物，为真菌天然产物挖掘提供了可行方法，其激活机制值得深入研究。
创新点
首次将原生质体诱变和基因组改组应用于内生真菌Tubercularia sp. TF5，证明该策略能有效激活沉默的次级代谢通路，产生结构多样的新化合物，为天然产物挖掘提供新方法。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Tubercularia sp. TF5 | — | — | — | 区室化 | 原始内生真菌菌株，长期培养后紫杉醇合成能力丧失 |
| Tubercularia sp. M-741 | — | — | — | 区室化 | UV/NTG诱变突变株，产生新倍半萜tuberculariols A-C |
| Tubercularia sp. G-444 | — | — | — | 区室化 | 基因组改组菌株，产生包括含氯化合物在内的多种新结构类型化合物 |
| — | 紫杉醇生物合成 | — | — | 催化 | 目标代谢通路，但在各菌株中均未检测到紫杉醇 |
| — | 倍半萜生物合成 | — | — | 催化 | 在M-741和G-444中被激活，产生多种新倍半萜 |
关键发现
- 优化原生质体制备条件：最佳组合为0.5% lywallzyme +
- 5% cellulase + 0% snail enzyme + 水解9 h，因素影响顺序为lywallzyme (R=23.5×10^4) > cellulase (18.5×10^4) > snail enzyme (11.7×10^4) > 水解时间 (11.3×10^4)。原生质体再生最佳组合为1.0% lywallzyme +
- 25% cellulase + 6 h，cellulase浓度影响最大（R=7.3%）。通过诱变获得860个突变株，基因组改组获得1100个菌株。从突变株M-741中分离得到3个新倍半萜tuberculariols A-C（1-3）和1个已知二氢异香豆素5-hydroxyemellein（4）；从改组菌株G-444中分离得到18个化合物，包括5个新倍半萜（5-9）、2个新二氢异香豆素（10,11）、1个新tetralone（12）及10个已知化合物。紫杉醇在TF5、M-741和G-444中均未检测到。TF5和G-444在紫杉醇浓度低于30 μg/ml时均可生长，高于40 μg/ml时显著受抑。
研究结论
原生质体诱变和基因组改组能有效激活内生真菌Tubercularia sp. TF5的沉默次级代谢，产生新的天然产物，该策略有望成为挖掘真菌天然产物的重要方法，理解其激活机制有助于调控真菌次生代谢。