Significant Rewiring of the Transcriptome and Proteome of an Escherichia coli Strain Harboring a Tailored Exogenous Global Regulator IrrE
- 作者
- Tingjian Chen, Jianqing Wang, Lingli Zeng, Rizong Li, Jicong Li, Yilu Chen, Zhanglin Lin
- 单位
- Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing, China; College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing, China
- 杂志
- PLoS ONE（2012）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0037126
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
揭示定向进化的外源全局调控因子IrrE突变体E1如何在大肠杆菌中实现转录组和蛋白质组的广泛重编程，从而赋予细胞乙醇耐受性，并解析其分子机制。
研究策略
比较携带乙醇耐受型IrrE突变体E1与野生型IrrE（E0）的大肠杆菌菌株，利用DNA微阵列进行转录组分析、2D凝胶电泳结合MALDI-TOF-MS进行蛋白质组分析；并通过胞内NO浓度测定、甘油补充和低温培养等实验验证关键通路。
研究路线图
核心内容
该研究通过比较携带乙醇耐受型IrrE突变体E1与野生型IrrE（E0）的大肠杆菌菌株，在基因组规模上揭示了外源全局调控因子对宿主代谢网络的重塑机制。利用DNA微阵列和蛋白质组学分析发现，E1菌株中约27%的基因（1196个）发生显著差异表达，其中688个上调、508个下调，同时鉴定出51个差异蛋白，KdsA为上调倍数最大的蛋白。关键发现包括NO代谢通路的上调使E1在乙醇应激下胞内NO浓度仅轻微升高，而E0显著累积；色氨酸转运与代谢、氧化磷酸化、甘油代谢以及非编码RNA均被显著激活，铁载体转运相关基因则被抑制。低温培养实验表明，降低膜流动性可增强乙醇耐受性，E1在5%乙醇下OD600为37°C时的5.1倍，补充甘油也能显著提高E0的耐受性。这些结果说明IrrE突变体通过协调多条下游通路赋予细胞乙醇耐受表型，证明外源全局调控因子经定向进化后可作为合成生物学的高层次调控元件，用于微生物基因组的系统性重编程。
创新点
首次在基因组规模上证明外源IrrE突变体能显著重编程大肠杆菌转录组（约27%基因改变）和蛋白质组；发现非编码RNA广泛参与乙醇应激响应；揭示NO代谢与膜流动性在乙醇耐受中的新作用；提出IrrE作为可进化的合成生物学全局调控元件。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α (菌株E1/E0) | 全局调控 | irrE（突变体E1） | IrrE（E1突变体） | 调控 | 源自耐辐射奇球菌的外源全局调控因子，经定向进化获得M19V、T42S、V100A、E275G四个表面突变，赋予大肠杆菌乙醇耐受性 |
| Escherichia coli DH5α | 硝酸盐-亚硝酸盐-NO代谢 | — | 硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、NO双加氧酶 | 催化 | 在E1中转录上调，促进NO转化为硝酸盐并最终降解，降低细胞内NO浓度 |
| Escherichia coli DH5α | 硝酸盐/亚硝酸盐转运 | — | 硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白 | 转运 | 在E1中转录上调，参与NO代谢 |
| Escherichia coli DH5α | 色氨酸代谢 | tnaA | TnaA（色氨酸酶） | 催化 | 显著上调，将色氨酸降解为吲哚，吲哚作为应激信号分子 |
| Escherichia coli DH5α | 色氨酸转运 | traB, mtr, traA | TraB/Mtr/TraA | 转运 | 上调，增加吲哚前体色氨酸的胞内浓度 |
| Escherichia coli DH5α | 铁转运 | feoA, feoB | FeoA/FeoB | 转运 | E1中上调（log2分别为1.78和1.73），亚铁转运增强 |
| Escherichia coli DH5α | 铁载体转运 | fepA, fhuA, fecA, fiu等 | FepA/FhuA/FecA/Fiu等外膜受体 | 转运 | 多数显著下调，如fiu为-5.07（log2），可能与降低三价铁摄取有关 |
| Escherichia coli DH5α | 氧化磷酸化 | sdhCDAB, nuoF等 | SdhA、NuoF、细胞色素d氧化酶等 | 能量供给 | 上调以加强质子梯度，抵抗乙醇引起的跨膜质子驱动力损失 |
| Escherichia coli DH5α | 甘油代谢 | glpC, glpD | GlpC（甘油-3-磷酸脱氢酶膜锚定亚基）、GlpD（甘油-3-磷酸脱氢酶） | 催化 | glpC为上调倍数最大的基因，甘油补充可提高E0乙醇耐受性 |
| Escherichia coli DH5α | 外膜蛋白 | ompW | OmpW | 转运 | 上调幅度最大，形成β-桶疏水通道，保护细胞免受有毒物质损伤 |
| Escherichia coli DH5α | 非编码RNA调控 | micF, ryhB, oxyS等 | — | 调控 | micF上调抑制OmpF表达，ryhB下调稳定bfr/sdhCDAB/sodB mRNA，oxyS下调；首次报道非编码RNA广泛参与乙醇应激响应 |
| Escherichia coli DH5α | 脂质A/脂多糖合成 | lpxA, kdsA | LpxA、KdsA | 催化 | KdsA为蛋白组中上调倍数最大的蛋白，LpxA催化脂质A生物合成第一步 |
| Escherichia coli DH5α | 活性氧清除 | sodB, sodC, katE, katG | 超氧化物歧化酶、过氧化氢酶 | 催化 | 转录上调，与E1胞内ROS水平较低一致 |
关键发现
- 转录组分析显示，携带IrrE突变体E1的菌株与携带野生型IrrE的E0相比，共有1196个基因（约27%的大肠杆菌基因）显著差异表达，其中688个上调、508个下调（|log2|>1）。显著上调的通路包括NO/硝酸盐/亚硝酸盐代谢、色氨酸转运与代谢、氧化磷酸化、甘油代谢，以及非编码RNA
- 显著下调的包括铁载体转运相关基因。蛋白质组分析识别出51个差异蛋白，其中22个上调、29个下调
- KdsA（脂多糖合成）为上调倍数最大蛋白，feoA/feoB（亚铁转运）log2值分别为1.78和1.73，fiu（铁载体受体）为-5.07。NO测定显示，乙醇应激下E0胞内NO浓度显著升高，而E1仅轻微增加。低温（30°C）培养时，E1在5%乙醇下OD600为37°C时的5.1倍，E0在4%乙醇下为45.6倍，表明降低膜流动性可增强乙醇耐受性。补充甘油显著提高E0的乙醇耐受性。
研究结论
IrrE突变体E1作为外源全局调控因子，可在转录组和蛋白质组层面广泛重编程大肠杆菌，通过上调NO解毒、色氨酸/吲哚信号、氧化磷酸化、甘油代谢等通路，同时调节铁转运、膜合成和多种非编码RNA，赋予细胞乙醇耐受性。IrrE是可进化的全局调控元件，具有作为合成生物学高层次调控‘部件’的潜力，并提示可引入和改造其他外源全局调控因子以重编程微生物基因组。