Cloning, Expression, and Enzyme Characterization of an Acid Heat-Stable Phytase from Aspergillus fumigatus WY-2
- 作者
- Yan Wang, Xiaorong Gao, Qiao Su, Wei Wu, Lijia An
- 单位
- Department of Bioscience and Biotechnology, School of Environment and Life, Dalian University of Technology, Dalian, 116024, P.R. China
- 杂志
- Current Microbiology（2007）
- DOI
- 10.1007/s00284-006-0613-5
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
饲料用植酸酶需要同时具备高热稳定性和高比活力，已知烟曲霉ATCC34625植酸酶热稳定性好但比活力较低，难以满足工业应用，需发掘新的高比活且热稳定的植酸酶。
研究策略
从土壤中分离烟曲霉WY-2菌株，克隆其植酸酶基因，构建pPIC9K重组表达载体，在毕赤酵母GS115中分泌表达，纯化后系统表征酶学性质（pH、温度、动力学、底物特异性、金属离子影响及蛋白酶耐受性）。
研究路线图
核心内容
从土壤中分离的烟曲霉WY-2菌株中克隆获得新型植酸酶基因（GenBank登录号AY745738），该基因全长1459 bp，编码465个氨基酸。将基因构建至pPIC9K载体并在毕赤酵母GS115中分泌表达，经甲醇诱导60 h后最高酶活达16 U/mL，较野生型菌株提高114倍。纯化酶比活力为51 U/mg，分子量约88 kDa，最适pH 5.5、最适温度55°C。该酶在90°C处理15 min后仍保留43.7%活性，表现出优异的热稳定性；在胃蛋白酶/植酸酶重量比为0.1时处理2 h仍保留90.1%活性，但胰蛋白酶敏感。动力学分析显示以植酸钠为底物时Km为114 μM，kcat为102 s⁻¹，催化效率达8.9×10⁵ M⁻¹s⁻¹。该酶与已知烟曲霉ATCC34625植酸酶氨基酸序列同源性为91%，但具有更高比活力和独特的pH-活性曲线，兼具高热稳定性和胃蛋白酶耐受性，适合饲料造粒工艺需求，可作为动物饲料添加剂候选酶，其高序列同源性也为植酸酶结构与机制研究提供了良好材料。
创新点
获得了来自烟曲霉WY-2的新型植酸酶基因，该酶相比已知烟曲霉植酸酶具有更高比活力、独特的pH-活性曲线和底物特异性，且兼具高热稳定性和强胃蛋白酶耐受性，适合饲料造粒工艺。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus fumigatus WY-2 | 植酸代谢 | phytase gene (GenBank: AY745738) | Phytase | 催化 | 基因供体菌，CICC保藏号40699；基因长1459 bp，编码465个氨基酸，含RHGXRXP和HD活性位点 |
| Pichia pastoris GS115 | 植酸代谢 | phytase gene（重组表达） | 重组植酸酶 | 催化 | 表达宿主，利用pPIC9K载体α-factor信号肽分泌表达，甲醇诱导60 h最高酶活16 U/mL，纯化酶比活力51 U/mg |
关键发现
- 植酸酶基因长1459 bp，编码465个氨基酸，GenBank登录号AY745738
- 在毕赤酵母中分泌表达，甲醇诱导60 h后最高酶活达16 U/mL，较野生型烟曲霉WY-2（0.14 U/mL）提高114倍
- 纯化酶比活力为51 U/mg，分子量约88 kDa
- 最适pH 5.5，最适温度55°C
- 在90°C处理15 min后，纯酶保留43.7%活性，粗酶保留42%
- 以植酸钠为底物时Km为114 μM，kcat为102 s⁻¹，kcat/Km为8.9×10⁵ M⁻¹s⁻¹
- 在胃蛋白酶/植酸酶重量比0.1时37°C处理2 h仍保留90.1%活性
- 但对胰蛋白酶敏感，胰蛋白酶/植酸酶重量比0.005时残留活性仅32.6%
- 氨基酸序列与A. fumigatus ATCC34625植酸酶同源性91%，与A. ficuum NRRL3135同源性66%
- 理论pI为5.95。
研究结论
从烟曲霉WY-2克隆并表达的植酸酶具有高比活力、高热稳定性、耐胃蛋白酶等优良特性，可作为动物饲料添加剂候选酶，其与已知烟曲霉植酸酶的高序列同源性有助于研究酶的结构与作用机制，并可为蛋白质工程改造提供基础。