Bio-transformation of Glycerol to 3-Hydroxypropionic Acid Using Resting Cells of Lactobacillus reuteri
- 作者
- Gopi Gopal Ramakrishnan, Ganesh Nehru, Pandiaraj Suppuram, Sowmiya Balasubramaniyam, Brajesh Raman Gulab, Ramalingam Subramanian
- 杂志
- Current Microbiology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00284-015-0878-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用 Lactobacillus reuteri 静息细胞将甘油生物转化为 3-羟基丙酸 (3-HP) 时，面临产物抑制、分解代谢物阻遏和产率低等挑战，需要优化细胞状态和转化策略以提高 3-HP 的产量和产率。
研究策略
采用静息细胞全细胞生物转化，比较对数期和稳定期收获的细胞的转化效率；通过定量 PCR 分析 3-HP 途径基因表达；研究 3-HP 产物抑制及 NAD+/NADH 比例变化；利用 CRE 突变体去除分解代谢物阻遏；采用重复分批生物转化（细胞循环）克服产物抑制。
核心内容
本研究利用罗伊氏乳杆菌静息细胞将甘油生物转化为3-羟基丙酸，系统比较了对数期与稳定期收获细胞的转化效率。结果显示，在含20 mM甘油的MRS培养基中，稳定期细胞pdu操纵子关键基因表达上调3.7倍，其最大比生产力达0.17 g 3-HP/g CDW/h，较对数期细胞提高2.54倍。研究还揭示了产物抑制作用：当外源3-HP浓度超过35 mM时，3-HP合成被完全抑制，1,3-PD产量降低73%，此时NAD+/NADH比值维持在6.5。为克服该抑制，研究者采用重复分批生物转化模式，使总产量较单批提高3.3倍，基于底物的总产率达0.275 g 3-HP/g甘油。此外，PduP酶活在转化过程中从0.57 U/mg蛋白降至0.23 U/mg蛋白。该工作表明，选择稳定期静息细胞并采用细胞循环策略，可有效缓解产物抑制与分解代谢物阻遏，显著提升3-HP产量，为低容量高价值化学品的生物合成提供了可行的工艺思路。
创新点
发现了稳定期细胞中 3-HP 途径基因的 3.7 倍上调，并首次将其与静息细胞转化效率关联；通过重复分批转化使总产量提高 3.3 倍；明确了 35 mM 3-HP 对合成及 1,3-PD 形成的抑制机制及 NAD+/NADH 比例为 6.5。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (wild-type) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | pduCDE | 甘油脱水酶 (glycerol dehydratase) | 催化 | 催化甘油脱水生成3-羟基丙醛 (3-HPA) |
| Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (wild-type) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | pduP | 丙醛脱氢酶 (propionaldehyde dehydrogenase) | 催化 | CoA和NAD(P)+依赖，催化3-HPA转化为3-HP-CoA |
| Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (wild-type) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | pduL | 磷酸转乙酰酶 (phosphotransacetylase) | 催化 | 催化3-HP-CoA转化为3-HP-磷酸 |
| Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (wild-type) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | pduW | 丙酸激酶 (propionate kinase) | 催化 | 生成3-HP和ATP |
| Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (wild-type) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | pduQ | 1,3-丙二醇脱氢酶 (1,3-propanediol dehydrogenase) | 催化 | 催化3-HPA还原为1,3-PD，再生NAD+ |
| Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (wild-type) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | pocR | PocR转录因子 | 调控 | 调控pdu操纵子表达，但过表达未提高3-HP产量 |
| Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (wild-type) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | CRE (catabolite repression element) | — | 调控 | 位于pdu操纵子上游的分解代谢物阻遏位点，其突变（CRE mutant）影响基因表达 |
| Lactobacillus reuteri RPRB 3007 (CRE mutant) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | pduCDE | 甘油脱水酶 (glycerol dehydratase) | 催化 | CRE突变体中仍保持稳定期上调，说明存在其他调控机制 |
| Lactobacillus reuteri ATCC 55730 (wild-type) | 甘油生物转化 (pdu 操纵子) | puuC | 醛脱氢酶 (aldehyde dehydrogenase, from E. coli) | 催化 | 异源过表达候选，低Km对3-HPA，可克服热力学障碍 |
关键发现
- 在含 20 mM 甘油的 MRS 培养基中，L. reuteri 稳定期细胞的 3-HP 途径基因（pduP、pduW、pduL）表达上调
- 7 倍；稳定期来源静息细胞的最大比生产力 (qp) 为
- 17 g 3-HP/g CDW/h，比对数期细胞高
- 54 倍；外部添加 3-HP 超过 35 mM 时，3-HP 合成完全抑制，同时 1,3-PD 产量降低 73%（相比对照），NAD+/NADH 比维持在
- 5±0.2；重复分批生物转化使总产量 (Ypx) 比单批模式高
- 3 倍，基于底物的总产率为
- 275 g 3-HP/g 甘油；生物转化过程中 PduP 酶活从初始
- 57 U/mg 蛋白下降至
- 23 U/mg 蛋白。
研究结论
使用稳定期收获的静息细胞，并采用重复分批生物转化模式，可有效克服产物抑制，显著提高 3-HP 的产量和产率，该策略适用于低容量、高价值的 3-HP 应用场景。