Energy Storage in Yeast: Regulation and Competition with Ethanol Production
- 作者
- Shilpa Jain, Hemal Dholakia, Winston Kirtley, Peter Oelkers
- 单位
- Department of Bioscience and Biotechnology, Drexel University; Department of Natural Sciences, University of Michigan-Dearborn; Trac Services Ltd
- 杂志
- Current Microbiology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00284-016-1127-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究酿酒酵母中三酰甘油合成的调控机制，并评估通过基因工程限制能量储存（糖原、三酰甘油、甾醇酯）是否能够提高乙醇生产效率。
研究策略
体外测定Dgalp酶动力学参数，检测潜在别构调控代谢物；比较糖原合成缺失与三酰甘油合成缺失菌株的储存补偿；构建多种能量储存缺陷菌株，在5%葡萄糖培养基中测定生长、葡萄糖消耗和乙醇产量；并评估乙醇耐受性。
核心内容
该研究以酿酒酵母为对象，探索能量储存（糖原、三酰甘油和甾醇酯）的调控机制及其对乙醇生产的竞争影响。作者体外表征了主要三酰甘油合成酶Dgalp的动力学参数，测得表观Km为17.0±5.6 μM，Vmax为5.8±2 nmol/min/mg，其Vmax比磷脂合成酶Lptlp低约20倍，提示Dgalp低容量特性使其成为三酰甘油合成的限速步骤；同时检测ATP、NADH、乙酰-CoA等多种代谢物，均未发现对Dgalp的显著别构调节，推测其活性可能主要通过蛋白丰度调控。进一步构建糖原合成缺失（gsy1Δgsy2Δ）等能量储存缺陷菌株，在5%葡萄糖培养基中测定发酵表现，结果显示单独敲除糖原合成基因可在不显著影响生长的情况下，将乙醇生产效率从野生型的37.3%提升至41.8%，提高约12%；而在8%乙醇平板上，中性脂合成缺失菌株生长受损，糖原缺失则可逆转该表型。这一发现表明限制糖原储存可减少碳流分流、增强乙醇生产，为工业酿酒酵母的遗传改造提供了可行策略。
创新点
首次对Dgalp（酵母主要DGAT）进行动力学表征，发现其高亲和低容量特性，支持其为TAG合成限速酶；系统评估了多种代谢物对Dgalp的别构调节，未发现调节作用；发现单独限制糖原合成可在不影响生长的情况下提高乙醇生产效率12%。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 三酰甘油合成 | DGA1 | Dgalp | 催化 | 二酰甘油O-酰基转移酶（DGAT），催化TAG合成的唯一专一步骤，表观Km 17.0 μM，Vmax 5.8 nmol/min/mg。 |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 磷脂合成 | LPT1 | Lptlp | 催化 | 1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶（AGPAT），产生磷脂酸，用于与Dgalp动力学比较。 |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 三酰甘油合成 | LRO1 | Lrolp | 催化 | 磷脂:二酰甘油酰基转移酶（PDAT），与Dga1p共同负责TAG合成。 |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 甾醇酯合成 | ARE1 | Are1p | 催化 | 甾醇酯化酶，与Are2p功能冗余，缺失影响中性脂合成。 |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 甾醇酯合成 | ARE2 | Are2p | 催化 | 甾醇酯化酶，与Are1p功能冗余，缺失影响中性脂合成。 |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 糖原合成 | GSY1 | Gsy1p | 催化 | 糖原合酶异构体，与Gsy2p联合缺失基本消除糖原合成。 |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 糖原合成 | GSY2 | Gsy2p | 催化 | 糖原合酶异构体，受营养调控，缺失后与Gsy1p共同影响糖原积累。 |
| Saccharomyces cerevisiae (W303) | 糖原分解 | GPH1 | Gph1p | 催化 | 糖原磷酸化酶，被提及与能量储存协调相关，实验设计参考。 |
关键发现
- Dgalp表观Km为17.0±5.6 μM，表观Vmax为5.8±2 nmol/min/mg，相比Lptlp的Km低约3倍，Vmax低20倍
- 未发现ATP、NADH、乙酰-CoA、丙二酰-CoA、AMP、ADP、NAD+等对Dgalp活性有显著别构调节
- gsy1Δgsy2Δ菌株在5%葡萄糖培养基中乙醇生产效率达41.8%，比野生型(37.3%)提高12%（p=0.07）
- 在8%乙醇平板上，中性脂合成缺失菌株（are1Δare2Δ、dga1Δlro1Δ等）生长受损，但糖原缺失可以逆转该表型。
研究结论
Dgalp因其低Vmax可能是三酰甘油合成的限速步骤，且不存在别构调节，可能通过蛋白丰度调控；通过敲除GSY1和GSY2限制糖原合成可在一定程度上提高乙醇生产效率，且对乙醇耐受性影响不大，可能为工业乙醇生产提供遗传改造策略。