Transcriptome Profiling, Cloning, and Characterization of AnGlu04478, a Ginsenoside Hydrolyzing β-Glucosidase from Aspergillus niger NG1306
- 作者
- Mingxing Jiang, Ling Zhu, Shuhan Xie, Zhen Ren, Xiu Chen, Minjiao Liu, Genshen Yin
- 杂志
- Current Microbiology（2024）
- DOI
- 10.1007/s00284-024-04012-0
- 所属领域
- 合成生物学
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解决的核心问题
挖掘并表征一种能同时催化人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc的C3位葡萄糖水解的β-葡萄糖苷酶，以制备多种稀有人参皂苷。
研究策略
以三七叶总皂苷为底物诱导黑曲霉NG1306生长，通过转录组测序筛选差异表达的β-葡萄糖苷酶基因Anglu04478，然后克隆至大肠杆菌BL21 Transetta (DE3)异源表达，经Ni²⁺亲和纯化后进行酶学性质表征和底物转化产物分析。
核心内容
以三七叶总皂苷为底物诱导黑曲霉NG1306，通过转录组测序筛选出差异表达的β-葡萄糖苷酶基因Anglu04478，克隆并异源表达于大肠杆菌BL21 Transetta (DE3)中，经Ni²⁺亲和纯化获得重组酶AnGlu04478。该酶属于GH1家族，最适pH 4.5、最适温度40℃，比活力为32.97 U/mg。关键特征在于它能同时水解人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc的C3位葡萄糖，分别生成GypXVII、C-O、C-Mx1/C-Mx和C-Mc1，表现出底物混杂性。值得注意的是，该酶具有高葡萄糖耐受性，在1 mol/L葡萄糖浓度下仍保留约50%活性，不受产物反馈抑制。实际转化中，以0.5 U酶处理0.5 mg总皂苷，40℃反应12 h后，GypXVII转化率达42.6%，Rc转化率为90%。AnGlu04478为利用多能酶催化制备多种稀有人参皂苷提供了新的酶学工具，尤其适用于含高浓度葡萄糖的反应体系。
创新点
首次报道来自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶AnGlu04478能同时水解人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc的C3位葡萄糖，生成GypXVII、C-O、C-Mx1/C-Mx和C-Mc1，且该酶具有高葡萄糖耐受性，不受产物反馈抑制。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus niger NG1306 | 人参皂苷生物转化 | Anglu04478 | AnGlu04478 | 催化 | 来源菌株，转录组筛选出该β-葡萄糖苷酶基因，催化人参皂苷C3位葡萄糖水解 |
| Escherichia coli BL21 Transetta (DE3) | — | — | — | — | 异源表达宿主，用于重组AnGlu04478的表达 |
关键发现
- Anglu04478基因长1455 bp，编码484个氨基酸，预测分子量54.54 kDa，pI 5.1
- 纯化酶对pNPG的比活力为32.97 U/mg，纯化倍数为1.7倍，回收率约41.9%
- 最适pH为4.5，最适温度为40℃
- 以pNPG为底物时Km为1.55 mmol/L，Vmax为0.014 mmol/min
- Cu²⁺抑制酶活，Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺影响较小
- 乙醇浓度>10%时活性显著下降，葡萄糖浓度为1 mol/L时残余活性约50%，表明高葡萄糖耐受
- 单独底物转化中，Rb1→GypXVII转化率15.38%，Rb2→C-O转化率2.58%，Rb3→C-Mx1为17.62%、C-Mx为13.01%，Rc→C-Mc1为20.63%
- 在0.5 U酶和0.5 mg总皂苷、40℃反应12 h条件下，GypXVII转化率42.6%、C-O为10.4%、C-Mx1为6.27%、C-Mx为26.96%、Rc为90%。
研究结论
AnGlu04478是一种GH1家族的β-葡萄糖苷酶，能在C3位选择性水解多种PPD型人参皂苷的葡萄糖基，生成相应稀有皂苷，具有底物混杂性和高葡萄糖耐受性，为多能酶催化人参皂苷生物转化提供了新的酶学工具。