Laccase from the white-rot fungus Trametes versicolor: cDNA cloning of lcc1 and expression in Pichia pastoris
- 作者
- Leif J. Jönsson, Markku Saloheimo, Merja Penttilä
- 杂志
- Current Genetics（1997）
- DOI
- 10.1007/s002940050298
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在Pichia pastoris中异源表达Trametes versicolor的laccase基因lcc1，以获得有活性的重组漆酶，用于生物漂白和废物处理等应用
研究策略
通过RNA-PCR克隆lcc1 cDNA，构建含天然信号肽和α-factor信号肽的表达载体，转化P. pastoris不同宿主菌株，优化pH和宿主蛋白酶缺陷以提升活性漆酶产量
核心内容
该研究通过RNA-PCR从变色栓菌中克隆了漆酶基因lcc1的cDNA，其全长1585 bp，编码含22 aa信号肽的498 aa漆酶前体。将天然信号肽与α-factor信号肽两种构建体分别转化毕赤酵母GS115及蛋白酶缺陷菌株SMD1168，系统评估了信号肽类型、宿主背景和培养pH对重组漆酶活性产量的影响。结果显示，天然信号肽构建体的分泌活性比α-factor信号肽构建体高约7倍，而pep4蛋白酶缺陷型菌株SMD1168的活性产量约为GS115的2倍。此外，pH低于4时无法获得活性漆酶，维持pH 6.0并每日调节是活性生产的必要条件，Mut+与MutS转化子活性水平则无显著差异。测序发现cDNA中有两处碱基替换，分别导致Asn377Asp和Phe466Leu。该研究首次实现了变色栓菌Lcc1漆酶在毕赤酵母中的功能性分泌表达，证实了pH调控与蛋白酶缺陷背景对活性产量的关键作用，并为后续漆酶的结构功能解析及定向进化提供了可行的异源表达平台。
创新点
1. 首次在P. pastoris中表达T. versicolor lcc1漆酶；2. 发现pH控制和pep4蛋白酶缺陷突变株显著提高活性产量；3. 发现天然信号肽优于α-factor信号肽
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Trametes versicolor | 木质素降解 | lcc1 | Laccase | 催化 | lcc1 cDNA编码498 aa漆酶前体，含22 aa信号肽 |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇利用 | AOX1 | Alcohol oxidase | 调控 | AOX1启动子驱动lcc1表达，受甲醇诱导 |
| Pichia pastoris SMD1168 | 蛋白质分泌 | pep4 | Proteinase A | 调控 | pep4缺失导致蛋白酶A失活，减少漆酶降解，活性提高2倍 |
| Pichia pastoris | 蛋白质分泌 | MFα1 | α-factor pre-pro peptide | 转运 | S. cerevisiae α-factor分泌信号代替天然信号肽，但效果较差 |
关键发现
- RNA-PCR获得1585 bp的lcc1 cDNA，编码498 aa漆酶和22 aa信号肽。在P. pastoris中表达，天然信号肽构建体活性比α-factor分泌信号构建体高7倍
- pep4缺陷型菌株SMD1168比GS115活性高2倍
- pH低于4不利于活性漆酶生产，pH 6.0缓冲和每日调节pH是获得活性的必要条件
- Mut+和MutS转化子活性水平相当
- cDNA中两处碱基替换导致Asn377Asp和Phe466Leu
研究结论
成功在P. pastoris中表达并分泌了有活性的T. versicolor漆酶Lcc1。pH控制和蛋白酶缺陷型菌株显著改善活性产量。天然信号肽优于α-factor信号肽。该表达系统可用于漆酶的结构-功能研究和定向进化