Growth and terpenoid indole alkaloid production in Catharanthus roseus hairy root clones in relation to left- and right-termini-linked Ri T-DNA gene integration
- 作者
- Jyoti Batra, Ajaswrata Dutta, Digvijay Singh, Sushil Kumar, Jayanti Sen
- 杂志
- Plant Cell Reports（2004）
- DOI
- 10.1007/s00299-004-0815-x
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究Ri T-DNA左端（TL-DNA）和右端（TR-DNA）基因的不同整合组合对长春花（Catharanthus roseus）毛状根克隆生长、形态及萜类吲哚生物碱积累的影响。
研究策略
用发根农杆菌A4菌株转化长春花叶片，建立250个独立毛状根克隆；根据形态分为四类；通过PCR和Southern杂交分析TL-DNA（rolA&B）和TR-DNA（ags）的整合情况；用HPLC测定代表性克隆中阿吗碱和蛇根碱的含量。
核心内容
该研究利用发根农杆菌A4菌株转化长春花叶片，建立了250个独立毛状根克隆，并根据形态将其分为四类。通过PCR和Southern杂交分析TL-DNA上的rolA&B基因与TR-DNA上的ags基因的整合状态，结合HPLC测定代表性克隆中阿吗碱和蛇根碱的含量，系统考察了Ri T-DNA左右端基因不同整合组合对毛状根生长、形态及萜类吲哚生物碱积累的影响。结果显示，A4菌株感染效率最高，52%的外植体在2-3周内诱导出毛状根；250个克隆中，236个为C1型（rolA&B+/ags+），2个为C2型（rolA&B−/ags+），12个为C3型（rolA&B+/ags−）。C2型克隆生长极缓慢，仅能维持10-12个月，且阿吗碱含量极低或可忽略，但蛇根碱含量有的接近C1克隆；C1和C3型克隆均可积累两种生物碱，但含量在克隆间差异大。该结果表明，rolA&B基因对毛状根诱导和持续生长至关重要，其缺失会严重阻碍生长并降低生物碱产量，而ags基因缺失不影响正常根表型和生物碱积累。这一发现为优化长春花毛状根培养体系、提高目标生物碱产量提供了重要的基因型筛选依据。
创新点
首次系统地将Ri T-DNA左右端基因整合状态与长春花毛状根的形态、生长和生物碱积累相关联，发现仅整合TR-DNA（C2类型）的克隆生长极慢且生物碱产量低，说明TL-DNA上的rolA&B对毛状根诱导和持续生长至关重要。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus var. Prabal 毛状根克隆 | 萜类吲哚生物碱生物合成 | rolA, rolB | — | 调控 | TL-DNA上的rolA和rolB基因影响毛状根的形态发生、生长速度和根的分支特征 |
| Catharanthus roseus var. Prabal 毛状根克隆 | 萜类吲哚生物碱生物合成 | ags | — | 催化 | TR-DNA上的农杆菌合酶基因，参与农杆菌（agropine）合成，其缺失（C3）不影响毛状根正常生长 |
关键发现
- A4菌株感染效率最高，52%的外植体在2-3周内诱导出毛状根
- 共获得250个独立根克隆，其中236个为C1（rolA&B+/ags+），2个为C2（rolA&B−/ags+），12个为C3（rolA&B+/ags−）
- Southern杂交显示多数克隆为单拷贝T-DNA整合，少数为2-3拷贝
- C2克隆生长缓慢，仅能维持10-12个月，且阿吗碱含量极低或可忽略，但蛇根碱含量有的接近C1克隆
- C1和C3克隆均可积累阿吗碱和蛇根碱，但含量在各克隆间差异大。
研究结论
Ri T-DNA的TL-DNA和TR-DNA基因共同影响长春花毛状根的生长和生物碱积累，其中rolA&B基因的缺失会导致毛状根生长严重受阻和生物碱产量下降，而ags基因缺失（C3）不影响正常根表型和生物碱积累。