Transcript profiling of terpenoid indole alkaloid pathway genes and regulators reveals strong expression of repressors in Catharanthus roseus cell cultures
- 作者
- Ajawsrata Dutta, Digvijay Singh, Sushil Kumar, Jayanti Sen
- 单位
- National Centre for Plant Genome Research, Jawaharlal Nehru University Campus, P.O. Box 10531, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110 067, India
- 杂志
- Plant Cell Reports（2007）
- DOI
- 10.1007/s00299-007-0305-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
长春花细胞培养中萜类吲哚生物碱（TIA）产量低，其分子调控机制尤其是新发现的TIA途径抑制子在细胞培养中的表达和功能尚不清楚，限制了细胞培养替代天然植物生产TIA的可行性。
研究策略
利用长春花旋转培养系统（叶或根诱导的致密愈伤组织簇CCC→悬浮细胞S→回复的致密愈伤组织簇R-CCC），通过cDNA macroarray、半定量RT-PCR和Northern blot分析MEP、莽草酸及TIA生物合成途径基因和调控因子（激活子和抑制子）的转录谱，并结合HPLC检测TIA积累，揭示细胞分化/增殖状态与基因表达及代谢物含量的关系。
核心内容
该研究利用长春花旋转培养系统（致密愈伤组织簇CCC、悬浮细胞S和回复的致密愈伤组织簇R-CCC），通过cDNA macroarray、半定量RT-PCR、Northern blot和HPLC分析，系统解析了MEP、莽草酸及TIA生物合成途径基因以及正负调控因子的转录谱与代谢物积累的关系。结果显示，CCC中可积累ajmalicine、serpentine和vindoline；S中TIA总量减少约10倍；R-CCC中ajmalicine较S高3倍、serpentine高7至8倍，vindoline在R-CCC可检测而S中不可检测。Tdc和Str呈双相表达模式，在CCC和R-CCC中高、S中低；G10h低表达，Dat未检测到。层次聚类显示高丰度基因簇全部为抑制子（Zct1、Zct2、Gbf2、Gbf3），而激活子Orca3表达水平最低，CrBpf1仅在S和R-CCC中表达。该工作首次综合揭示TIA途径抑制子在细胞培养中持续强表达、激活子表达极低是TIA产量受限的关键分子因素，为通过调控正负调控因子改造长春花细胞培养生产TIA提供了新靶点。
创新点
['首次在长春花细胞培养中同时对TIA途径生物合成基因、激活子和抑制子进行综合转录谱分析', '采用CCC→S→R-CCC旋转培养系统，在分化与增殖交替条件下动态解析TIA基因表达', '发现TIA途径抑制子在细胞培养中持续高表达，而激活子ORCA3表达极低，提示抑制子是TIA产量的关键限制因素']
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | MEP途径 | Mecs | 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase | 催化 | MEP途径基因，在CCC、S和R-CCC中相对高表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | MEP途径 | Dxr | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase | 催化 | MEP途径基因，与Mecs同属高丰度表达簇 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | MEP途径 | G10h | geraniol 10-hydroxylase | 催化 | MEP途径关键羟化酶，在S和R-CCC中低表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | 莽草酸途径 | As | anthranilate synthase | 催化 | 莽草酸途径基因，表达水平较低 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | 莽草酸途径 | Sls | secologanin synthase | 催化 | TIA前体供给相关，在S中未检出表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Tdc | tryptophan decarboxylase | 催化 | 编码色氨酸脱羧酶，在CCC和R-CCC中高表达，S中低 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Str | strictosidine synthase | 催化 | 编码异胡豆苷合酶，表达模式与Tdc相似，呈双相 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Sgd | strictosidine glucosidase | 催化 | 参与异胡豆苷水解，表达极低或未检出 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | T16h | tabersonine 16-hydroxylase | 催化 | 下游文多灵途径基因，在S中表达降低 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Omt | 16-hydroxytabersonine O-methyltransferase | 催化 | 文多灵途径甲基转移酶，低丰度表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | D4h | desacetoxyvindoline 4-hydroxylase | 催化 | 文多灵途径酶，在S中表达较低 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Dat | deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase | 催化 | 文多灵途径末端酶，Northern检测未表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Orca3 | octadecanoid-derivative responsive Catharanthus AP2-domain protein 3 | 调控 | TIA途径主激活子，表达水平在所有调控因子中最低 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | CrBpf1 | MYB transcription factor | 调控 | MYB转录因子，在S和R-CCC中表达较高 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Gbf1 | G-box binding factor 1 | 调控 | G-box结合因子，作为抑制子，在S中上调 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Gbf2 | G-box binding factor 2 | 调控 | G-box结合因子，抑制子，在所有培养条件下高表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Gbf3 | G-box binding factor 3 | 调控 | G-box结合因子，抑制子，在S中高表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Zct1 | zinc finger protein 1 | 调控 | C2H2锌指蛋白，转录抑制子，在S中高表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Zct2 | zinc finger protein 2 | 调控 | C2H2锌指蛋白，转录抑制子，高丰度表达 |
| Catharanthus roseus 细胞培养物（CCC/S/R-CCC） | TIA生物合成途径 | Zct3 | zinc finger protein 3 | 调控 | C2H2锌指蛋白，转录抑制子，表达相对较低 |
关键发现
- ['CCC培养中可积累ajmalicine、serpentine和vindoline
- S培养中TIA总量减少约10倍
- R-CCC中ajmalicine较S培养高3倍，serpentine高7-8倍，vindoline在R-CCC中可检测而S中不可检测。', 'Tdc和Str转录水平在CCC和R-CCC中较高，在S中显著降低，呈双相表达模式
- G10h在S和R-CCC中低表达，Dat在Northern分析中未检测到。', '抑制子Gbf1、Gbf3和Zct1在悬浮细胞（S）中上调，Zct2和Gbf2在CCC、S和R-CCC中均高表达
- 激活子Orca3表达水平最低，CrBpf1在S和R-CCC中表达较高。', '层次聚类显示TIA途径基因分为高丰度簇（Dxr、Mecs、Tdc、Str）和低丰度簇（T16h、D4h、Dat等）
- 调控因子中高丰度簇全为抑制子（Zct1、Zct2、Gbf2、Gbf3），低丰度簇包含Orca3、CrBpf1等。']
研究结论
长春花细胞培养中TIA途径抑制子的持续强表达是限制TIA生物合成的重要因素，需通过精细调控正负调控因子或抑制这些抑制子来提升TIA产量，为细胞培养生产TIA的工程化改造提供了新靶点。