Cloning and characterization of 2-C-methyl-d-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase (MECS) gene from Ginkgo biloba
- 作者
- Sang-Min Kim, Tomohisa Kuzuyama, Yung-Jin Chang, Soo-Un Kim
- 杂志
- Plant Cell Reports（2006）
- DOI
- 10.1007/s00299-006-0136-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
银杏内酯生物合成途径中的关键酶MECS基因尚未克隆和功能验证，需从银杏中克隆并表征该基因，研究其表达模式及亚细胞定位。
研究策略
利用同源克隆和RACE技术从银杏胚根中克隆GbMECS cDNA，进行序列分析、系统发育分析和同源建模；通过大肠杆菌ygbB突变株NMW26互补实验验证催化功能；用实时定量RT-PCR检测转录水平；通过GbMECS-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达验证叶绿体靶向。
研究路线图
核心内容
该研究从银杏胚根中克隆了编码2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶（MECS）的基因GbMECS，并对其进行了功能鉴定。通过同源克隆和RACE技术获得全长cDNA（935 bp），开放阅读框717 bp，编码238个氨基酸的蛋白前体，含59个氨基酸的N端叶绿体转运肽，去除后成熟蛋白约179个氨基酸，理论分子量19.3 kDa。序列比较显示该蛋白与植物MECS的一致性为70%–78%，去除转运肽后可达81%–86%。功能验证采用大肠杆菌ygbB缺陷突变株NMW26进行互补实验，结果表明GbMECS能恢复该菌株在无甲羟戊酸条件下的生长，证明其具备MECS催化活性。实时定量RT-PCR显示该基因在胚根中的转录水平比胚叶高至少2倍，推测其参与根中银杏内酯合成。亚细胞定位实验通过GbMECS-GFP融合蛋白在拟南芥原生质体中的瞬时表达，确认其定位于叶绿体。该研究首次从裸子植物中克隆并表征了MECS基因，为阐释银杏内酯生物合成的组织特异性调控机制及后续代谢工程改造提供了分子基础。
创新点
首次从裸子植物银杏中克隆并功能鉴定MECS基因，证明其能互补大肠杆菌ygbB缺陷突变体，并证实其定位于叶绿体。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli NMW26 | MEP途径 | ygbB (EcMECS) | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 (MECS) | 催化 | 用于功能互补实验，GbMECS可恢复突变株生长 |
| 拟南芥原生质体 | MEP途径 | GbMECS | GbMECS-GFP融合蛋白 | 催化 | 瞬时表达验证GbMECS定位于叶绿体 |
| Ginkgo biloba | MEP途径 | GbMECS (AY494187) | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 从银杏胚根中克隆，参与银杏内酯生物合成 |
关键发现
- GbMECS cDNA全长935 bp，ORF为717 bp，编码238个氨基酸
- 预测N端叶绿体转运肽为59个氨基酸，去除后成熟蛋白含179个氨基酸，理论分子量19.3 kDa，pI 6.47
- 与植物MECS序列一致性为70-78%，去除转运肽后达81-86%
- 转录水平在胚根中比胚叶高至少2倍
- 互补实验证明GbMECS恢复了大肠杆菌NMW26在无甲羟戊酸条件下的生长，表明具有MECS催化活性。
研究结论
从银杏中成功克隆并表征了GbMECS基因，其编码蛋白具有2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶活性，定位于叶绿体，且在根中高表达，参与银杏内酯的生物合成。