Isolation and functional analysis of the Catharanthus roseus deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase gene promoter

作者: Quan Wang, Fang Yuan, Qifang Pan, Meiya Li, Guofeng Wang, Jingya Zhao, Kexuan Tang
杂志: Plant Cell Reports（2009）
DOI: 10.1007/s00299-009-0811-2
所属领域: 代谢工程
关键词: Catharanthus roseusDeacetylvindoline-4-O-acetyltransferaseGUS activityMetyljasmonatePromoter
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解决的核心问题

分离并表征长春花（Catharanthus roseus）中催化文多灵生物合成最后一步的去乙酰文多灵-4-O-乙酰转移酶（DAT）基因启动子，并鉴定其响应茉莉酸甲酯（MeJA）的顺式作用元件

研究策略

采用基因组步移法（Genome Walker）克隆DAT基因启动子；通过5'端缺失和功能获得缺失构建启动子与GUS报告基因的融合载体，利用农杆菌介导的瞬时转化在长春花细胞悬浮系中检测启动子活性；结合PLACE和PlantCARE数据库进行顺式元件预测；并用MeJA处理分析启动子及DAT转录水平的响应

研究路线图

100%

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核心内容

该研究通过基因组步移法从长春花中克隆了约1773 bp的DAT基因启动子，并利用5′端系列缺失和GUS报告基因融合载体，在农杆菌介导的瞬时转化体系中系统分析了其功能。转录起始位点定位于起始密码子上游-13 bp处的腺嘌呤，TATA-box与其相距34 bp。启动子活性分析显示，-428至-120 bp区域对维持基础表达至关重要，缺失至-120时GUS活性降低80%。在MeJA响应方面，-1086至-808 bp区域内的三个TGACG基序和一个反向CGTCA基序是茉莉酸甲酯信号转导的关键顺式元件，删除该片段后MeJA诱导倍数由约25倍降至11倍。MeJA处理8 h后DAT转录水平达到峰值，且该响应机制不同于其他萜类吲哚生物碱通路基因启动子。研究明确了DAT启动子中基础表达和MeJA诱导的顺式元件分布，为利用该启动子调控长春花中萜类吲哚生物碱的合成提供了分子工具。

创新点

首次克隆并功能分析了长春花DAT基因启动子，确定了转录起始位点；发现-428至-120 bp区域对基础表达至关重要；鉴定出位于-1,086至-808 bp区域的三个TGACG基序和一个反向CGTCA基序参与MeJA信号转导，且该MeJA响应元件不同于已知的其他TIA通路基因启动子

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
长春花（Catharanthus roseus）细胞悬浮系	文多灵生物合成（萜类吲哚生物碱TIA生物合成）	DAT（deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase）	去乙酰文多灵-4-O-乙酰转移酶	催化	催化文多灵生物合成最后一步，本研究克隆并分析其启动子
长春花（Catharanthus roseus）细胞悬浮系	茉莉酸甲酯（MeJA）信号转导	TGACG/CGTCA基序（顺式作用元件）	—	调控	位于DAT启动子-1086至-808 bp区域，参与MeJA响应调控

关键发现

克隆得到约1,773 bp的DAT启动子片段
转录起始位点（TSS）为起始密码子上游-13 bp处的腺嘌呤，TATA-box与TSS间距34 bp。全长启动子（-1,665至+74）GUS活性为1.7 nmol MU/min/mg蛋白
缺失至-1,039和-428时活性分别降低13.2%和18.3%，缺失至-252时降低45.7%，缺失至-120时降低80%。分别缺失-428至-252和-252至-120区段后，GUS活性仅为构建体2的47.7%和28.9%，后者活性是前者的1.7倍。MeJA处理8 h后，DAT mRNA水平达到峰值
全长启动子GUS活性被MeJA诱导约25倍，而缺失-1,086至-808片段后仅诱导11倍

研究结论

DAT基因启动子的-428至-120 bp区域含有维持基础表达所必需的顺式元件，其中-252至-120区域作用更强；-1,086至-808 bp区域内的TGACG/CGTCA基序是MeJA响应的关键顺式元件，且该响应机制不同于其他TIA生物合成基因启动子