Overexpression of G10H and ORCA3 in the hairy roots of Catharanthus roseus improves catharanthine production
- 作者
- Cui-Ting Wang, Hua Liu, Xiao-Shu Gao, Hong-Xia Zhang
- 单位
- 中国科学院上海植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室
- 杂志
- Plant Cell Reports（2010）
- DOI
- 10.1007/s00299-010-0874-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长春花中抗癌双吲哚生物碱长春碱和长春新碱含量极低（鲜重中分别为5.8 μg/g和0.9 μg/g），而长春花发状根中长春质碱（catharanthine）的产量提升尚未见报道。本研究旨在通过代谢工程手段提高发状根中长春质碱的积累。
研究策略
利用发根农杆菌MSU440介导转化长春花，构建单独过表达G10H（由CaMV 35S启动子驱动）或共表达G10H与ORCA3（ORCA3由逆境诱导型rd29A启动子驱动）的载体，获得转基因发状根克隆；通过ABA或低温处理诱导ORCA3表达，采用HPLC测定4种生物碱含量，用RT-PCR分析TIAs生物合成相关基因的表达水平。
核心内容
该研究通过发根农杆菌介导的遗传转化，在长春花发状根中单独过表达香叶醇10-羟化酶基因G10H（由CaMV 35S启动子驱动）或将其与逆境诱导型rd29A启动子驱动的转录因子ORCA3共表达，旨在提升抗癌前体长春质碱的积累。HPLC检测显示，所有转基因克隆的长春质碱含量均显著高于野生型，其中共表达克隆OG12在正常条件下含量达0.123%干重，较野生型M3高6.5倍；经ABA诱导后进一步提升至1.96 mg/g干重。低温处理对部分克隆亦有增强效果。RT-PCR分析表明，ORCA3过表达增强了STR和SLS基因表达，而G10H的作用更为关键。然而所有发状根中均未检测到vindoline及双吲哚生物碱，原因在于D4H和DAT基因几乎不表达。该结果证实G10H是长春质碱合成的重要限速环节，但发状根体系缺乏vindoline合成能力，未来需关注SGD等下游基因调控及组织分化差异，才能实现双吲哚生物碱的完整生物合成。
创新点
首次在长春花发状根中通过过表达G10H或共表达G10H与ORCA3显著提高长春质碱产量；利用ABA/低温诱导型启动子驱动ORCA3表达，实现可控过表达；揭示了G10H在长春质碱合成中比ORCA3更为关键。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | G10H | 香叶醇10-羟化酶 (geraniol 10-hydroxylase) | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，催化香叶醇生成10-羟基香叶醇，TIAs途径的第一个限速步骤 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | ORCA3 | ORCA3转录因子 | 调控 | 茉莉酸应答的AP2结构域转录因子，可上调TDC、STR、CPR等多个TIAs生物合成基因的表达 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | ASz | 邻氨基苯甲酸合酶 α亚基 (anthranilate synthase alpha subunit) | 催化 | 参与色氨酸合成，为TIAs提供前体 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | CPR | 细胞色素P450还原酶 (cytochrome P450 reductase) | 催化 | 为P450酶提供电子，参与氧化还原反应 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | SLS | 裂环马钱子苷合酶 (secologanin synthase) | 催化 | 催化马钱子苷裂环形成裂环马钱子苷 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | TDC | 色氨酸脱羧酶 (tryptophan decarboxylase) | 催化 | 催化色氨酸脱羧形成色胺 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | STR | 异胡豆苷合酶 (strictosidine synthase) | 催化 | 催化裂环马钱子苷与色胺缩合形成异胡豆苷，TIAs途径的关键酶 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | D4H | 脱乙酰氧基长春多灵4-羟化酶 (desacetoxyvindoline 4-hydroxylase) | 催化 | 参与vindoline生物合成，在发状根中几乎不表达 |
| Catharanthus roseus (长春花) 发状根培养物 | 萜类吲哚生物碱(TIAs)生物合成途径 | DAT | 脱乙酰长春多灵4-O-乙酰转移酶 (deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase) | 催化 | 参与vindoline生物合成的最后一步，在发状根中几乎不表达 |
关键发现
- 所有转基因发状根克隆的长春质碱积累均增加，最高克隆OG12在正常条件下比非表达克隆M3高6.5倍（0.123% DW vs 0.019% DW），比M5高4.2倍（0.029% DW）
- ABA处理后OG12中长春质碱含量达1.96 mg/g DW（即0.196% DW）。正常条件下野生型系M3和M5的长春质碱含量分别为0.019%和0.029% DW，GH系为0.063–0.107%，OG系为0.075–0.123%。ABA或低温处理对GH系无显著影响，但ABA处理显著提高了OG12和OG13的长春质碱含量，低温处理仅提高OG12。此外，vindoline、vinblastine和vincristine在对照及转基因发状根中均未检测到。ORCA3过表达系中STR和SLS表达增强，而ASz、CPR、TDC表达无显著差异，D4H和DAT几乎不表达。
研究结论
过表达G10H或共表达G10H与ORCA3可显著提高长春花发状根中长春质碱的积累，其中G10H起关键作用。由于发状根中D4H和DAT基因几乎不表达，导致vindoline缺失，从而无法合成双吲哚生物碱。未来的研究应关注SGD等基因的表达以及发状根与植株之间分化调控的差异，以进一步提高双吲哚生物碱产量。