Functional Analysis of the Phycomyces carRA Gene Encoding the Enzymes Phytoene Synthase and Lycopene Cyclase
- 作者
- Catalina Sanz, Antonio Velayos, Maria Isabel Álvarez, Ernesto P. Benito, Arturo P. Eslava
- 单位
- Department of Microbiology and Genetics, University of Salamanca, Salamanca, Spain; Centro Hispano-Luso de Investigaciones Agrarias, University of Salamanca, Salamanca, Spain
- 杂志
- PLoS ONE（2011）
- DOI
- 10.1371/journal.pone.0023102
- 所属领域
- 代谢工程
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
验证Phycomyces blakesleeanus的carRA基因编码的蛋白质是否同时具有八氢番茄红素合酶（phytoene synthase）和番茄红素环化酶（lycopene cyclase）活性，此前仅有序列同源性推断而无直接功能证据。
研究策略
通过异源表达和功能互补策略：将Phycomyces的carRA基因转化至Mucor circinelloides的类胡萝卜素合成缺陷突变株中，观察β-胡萝卜素恢复情况；同时在大肠杆菌中与Erwinia类胡萝卜素合成基因共表达，测定新合成类胡萝卜素。
研究路线图
核心内容
该研究通过异源表达与功能互补实验，首次直接证实了Phycomyces blakesleeanus的carRA基因编码一个双功能酶，兼具八氢番茄红素合酶和番茄红素环化酶活性。研究者将该基因导入Mucor circinelloides类胡萝卜素合成缺陷株，三个转化子T7、T8和T21分别恢复合成520±36、380±22和352±19 ng/gdw的β-胡萝卜素，而未转化菌株无该产物。在大肠杆菌中，carRA cDNA互补crtB突变体时产生11.18±2 ng/gdw番茄红素和4.22±2 ng/gdw β-胡萝卜素；互补crtY突变体时产生87.71±25 ng/gdw番茄红素和6.46±0.5 ng/gdw β-胡萝卜素，而单独carRA无法互补双突变。值得注意的是，当carB与carRA共表达时，双突变体能产生0.96±0.3 ng/gdw β-胡萝卜素，表明CarB与CarRA的相互作用对高效合成至关重要。该结果不仅为carRA的双功能催化活性提供了直接遗传证据，还揭示了类胡萝卜素合成酶复合体的存在及其对催化效率的重要影响，为后续代谢工程改造类胡萝卜素合成途径提供了理论依据。
创新点
首次提供了Phycomyces carRA基因双功能酶活性的直接实验证据；发现carB与carRA共表达能提高异源体系中的类胡萝卜素合成效率，提示酶复合物形成的重要性。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Mucor circinelloides | 类胡萝卜素生物合成 | carRA | CarRA | 催化 | 来自Phycomyces blakesleeanus的异源基因，在Mucor突变株中互补，恢复β-胡萝卜素合成 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | carRA | CarRA | 催化 | 异源表达，互补crtB或crtY突变，证明具有八氢番茄红素合酶和番茄红素环化酶活性 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | carB | CarB | 催化 | 来自Phycomyces的八氢番茄红素脱氢酶，与carRA共表达提高催化效率 |
| Mucor circinelloides | 类胡萝卜素生物合成 | carRP | CarRP | 催化 | Mucor内源同源基因，被carRA互补 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB | 催化 | 来自Erwinia uredovora的八氢番茄红素合酶，用于构建carotenoid mutant |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | CrtY | 催化 | 来自Erwinia的番茄红素环化酶 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE | 催化 | 来自Erwinia的GGPP合酶 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI | 催化 | 来自Erwinia的八氢番茄红素脱氢酶 |
关键发现
- Mucor转化子T7、T8和T21中β-胡萝卜素含量分别为520±36 ng/gdw、380±22 ng/gdw和352±19 ng/gdw，未转化菌株无β-胡萝卜素
- 在大肠杆菌中，carRA cDNA互补crtB突变体时产生11.18±2 ng/gdw番茄红素和4.22±2 ng/gdwβ-胡萝卜素
- 互补crtY突变体时产生87.71±25 ng/gdw番茄红素和6.46±0.5 ng/gdwβ-胡萝卜素
- 单独carRA不能互补crtB/crtY双突变，但当carB与carRA共表达时能产生0.96±0.3 ng/gdwβ-胡萝卜素。
研究结论
研究表明Phycomyces blakesleeanus的carRA基因确实编码一个具有八氢番茄红素合酶和番茄红素环化酶活性的双功能酶，异源表达证实其功能；同时，CarB与CarRA的相互作用对于高效合成β-胡萝卜素至关重要，提示天然类胡萝卜素酶复合体对催化效率的重要影响。