Inducibility of three salinity/abscisic acid-regulated promoters in transgenic rice with gusA reporter gene
- 作者
- Moumita Ganguly, Aryadeep Roychoudhury, Sailendra N. Sarkar, Dibyendu N. Sengupta, Swapan K. Datta, Karabi Datta
- 单位
- Plant Molecular Biology and Biotechnology Laboratory, Department of Botany, University of Calcutta; Department of Biotechnology, St. Xavier's College; Division of Plant Biology, Bose Institute (Main Campus)
- 杂志
- Plant Cell Reports（2011）
- DOI
- 10.1007/s00299-011-1072-4
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
评估三种盐胁迫/ABA诱导启动子（天然Rab16A启动子与两个合成启动子4X ABRE、2X ABRC）在不同浓度NaCl和ABA处理下的诱导模式，为单子叶作物逆境胁迫下的转基因表达提供可选启动子。
研究策略
将天然Rab16A启动子和两个合成启动子（4X ABRE、2X ABRC）分别与gusA报告基因融合构建于pBI121载体，通过基因枪生物弹道法转化水稻品种Khitish，获得T2代转基因系，并通过RT-PCR、qRT-PCR、组织化学染色和荧光定量GUS活性测定分析不同浓度NaCl（0、100、150 mM）和ABA（0、50、100 μM）处理下的启动子诱导特性。
核心内容
本研究以水稻品种Khitish为材料，系统比较了天然Rab16A启动子与两个合成启动子4X ABRE、2X ABRC在盐胁迫和ABA处理下的诱导特性。三种启动子分别与gusA报告基因融合，通过基因枪法转化水稻获得T2代转基因系，并在0、100、150 mM NaCl和0、50、100 μM ABA梯度处理下，利用qRT-PCR、组织化学染色和GUS荧光定量分析启动子响应模式。结果显示，所有启动子的表达均随处理浓度升高而增强，且ABA的诱导效果强于NaCl。其中2X ABRC启动子诱导倍数最高，在150 mM NaCl和100 μM ABA下分别达到22.6倍和31.2倍，对应GUS活性为150和161 pmol h⁻¹ μg⁻¹；组织化学染色进一步发现该启动子能在种子胚和胚乳糊粉层中驱动表达，而Rab16A和4X ABRE仅在胚中表达。这一特性使2X ABRC启动子在单子叶作物的逆境胁迫转基因工程中具有更广的应用潜力，其余两种启动子则可根据具体组织表达需求选用。
创新点
系统比较了天然启动子与合成多拷贝ABRE/ABRC启动子在盐和ABA梯度浓度下的诱导响应；发现2X ABRC启动子在种子胚和胚乳中均能驱动表达，而其他两种启动子仅限于胚中表达。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 水稻（Oryza sativa cv. Khitish） | ABA信号通路/盐胁迫响应 | Rab16A | — | 调控 | 天然启动子，含motif I (ABRE)和motif IIa/IIb (CE样序列)，来自耐盐品种Nonabokra |
| 水稻（Oryza sativa cv. Khitish） | ABA信号通路 | 4X ABRE | — | 调控 | 合成启动子，含有四个串联ABRE拷贝（来自小麦Em的Emla序列） |
| 水稻（Oryza sativa cv. Khitish） | ABA信号通路 | 2X ABRC | — | 调控 | 合成启动子，含两个ABRE拷贝和两个CE（CE1来自大麦HVA22） |
| 水稻（Oryza sativa cv. Khitish） | 报告基因系统 | gusA | β-葡萄糖醛酸酶 (GUS) | 催化 | 报告基因，用于检测启动子活性 |
| 水稻（Oryza sativa cv. Khitish） | 选择标记 | hpt | 潮霉素磷酸转移酶 | 催化 | 位于pGL2载体上的筛选标记基因 |
关键发现
- 所有三种启动子的GUS表达随NaCl和ABA浓度升高而增强，ABA比NaCl诱导效果更强。qRT-PCR显示，Rab p（T2/20）在150 mM NaCl和100 μM ABA下分别诱导8.2倍和10倍
- 4X ABRE（T2/2）分别诱导16倍和20.8倍
- 2X ABRC（T2/4）分别诱导22.6倍和31.2倍。GUS荧光定量最大活性分别为：Rab p在150 mM NaCl下92 pmol h^-1 μg^-1，100 μM ABA下100 pmol h^-1 μg^-1
- 4X ABRE分别为116和142 pmol h^-1 μg^-1
- 2X ABRC分别为150和161 pmol h^-1 μg^-1。组织化学染色显示2X ABRC在种子胚和胚乳（糊粉层）中均有表达，而Rab p和4X ABRE仅在胚中表达。
研究结论
三种启动子均能响应盐和ABA胁迫诱导表达，其中2X ABRC启动子诱导倍数最高，且能驱动种子胚乳表达，最适合应用于单子叶作物（如水稻、玉米、大麦、小麦）的逆境胁迫转基因工程；Rab p和4X ABRE启动子也可根据具体表达需求选用。