Assessment of genetic and epigenetic variation during long-term Taxus cell culture
- 作者
- Chunhua Fu, Liqin Li, Wenjuan Wu, Maoteng Li, Xiaoqing Yu, Longjiang Yu
- 单位
- Department of Biotechnology, College of Life Science and Technology, Institute of Resource Biology and Biotechnology, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Molecular Biophysics of Ministry of Education; Huzhou Key Laboratory of Molecular Medicine, Huzhou Central Hospital
- 杂志
- Plant Cell Reports（2012）
- DOI
- 10.1007/s00299-012-1251-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
长期继代培养中红豆杉细胞紫杉醇生物合成能力逐渐丧失的机制不明，需要评估遗传和表观遗传变异以探究次生代谢产物合成能力下降的原因。
研究策略
对红豆杉（Taxus media cv. Hicksii）细胞进行5年长期培养，通过细胞形态学观察、紫杉醇含量HPLC检测、实时定量RT-PCR分析关键基因转录水平、AFLP分析遗传变异、MSAP和HPLC分析DNA甲基化水平，综合评估遗传与表观遗传变化。
核心内容
本研究对红豆杉（Taxus media cv. Hicksii）细胞进行了长达5年的继代培养，以探究紫杉醇生物合成能力长期下降的机制。通过HPLC检测发现，紫杉醇积累量从初始的452 μg/g降至第5年的42 μg/g，10-去乙酰巴卡亭III也由741 μg/g降至237 μg/g。实时定量RT-PCR显示关键合成基因GGPPS、DXR、HMGR和DBAT的转录水平分别下降约10³至10⁵倍。AFLP分析获得1,834个片段但未检测到多态性，表明未发生显著遗传重组；而MSAP和HPLC分析显示，总DNA甲基化水平随培养时间从12.2%升至18.8%，5-甲基脱氧胞苷含量增加约8.7%。生物量增长倍数反而由1.25倍升至3.45倍。结果表明，长期培养中紫杉醇产量下降与DNA甲基化水平升高显著负相关，提示表观遗传修饰而非遗传重排可能是导致次生代谢产物合成能力丧失的重要原因，为红豆杉细胞规模化培养的稳定性调控提供了新靶点。
创新点
首次报道红豆杉细胞培养时间延长伴随DNA甲基化水平升高；结合AFLP、MSAP和HPLC多种技术系统评估长期培养中遗传与表观遗传变异；提出DNA甲基化可能参与调控紫杉醇生物合成。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taxus media cv. Hicksii | 紫杉醇生物合成（非甲羟戊酸途径） | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 非甲羟戊酸途径关键酶 |
| Taxus media cv. Hicksii | 紫杉醇生物合成（甲羟戊酸途径） | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 甲羟戊酸途径第一个关键酶 |
| Taxus media cv. Hicksii | 紫杉醇生物合成 | GGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 参与紫杉醇早期生物合成 |
| Taxus media cv. Hicksii | 紫杉醇生物合成 | DBAT | 10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰转移酶 | 催化 | 参与紫杉醇后期生物合成步骤 |
关键发现
- 紫杉醇积累从初始的452 μg/g降至第5年的42 μg/g
- 10-去乙酰巴卡亭III（10-DAB）从741 μg/g降至237 μg/g。第5年细胞中GGPPS和DXR转录水平下降近10^3倍，HMGR下降近10^4倍，DBAT下降近10^5倍。AFLP分析共获得1,834个DNA片段，未发现多态性位点。MSAP分析显示总甲基化水平范围为12.2%-18.8%，其中5年培养组最高（18.8%），初始诱导组最低（12.2%）
- 超甲基化水平为1.4%-2.4%，CpCpG甲基化4.7%-6.9%，CpG甲基化6.2%-9.6%。HPLC定量显示，与初始组相比，5年继代样本中5-甲基脱氧胞苷水平显著增加约8.7%，短期样本内变异约1.5%。生物量增长倍数从初始的1.25倍升至5年时的3.45倍。
研究结论
长期培养过程中未检测到主要遗传重排（AFLP无多态性），但DNA甲基化水平随培养时间延长显著升高，且与紫杉醇产量下降呈显著负相关，表明DNA甲基化可能参与调控红豆杉细胞紫杉醇生物合成的长期不稳定。