Functional expression and characterization of sesquiterpene synthases from Artemisia annua L. using transient expression system in Nicotiana benthamiana
- 作者
- Selvaraju Kanagarajan, Saraladevi Muthusamy, Anna Gliszczynska, Anneli Lundgren, Peter E. Brodelius
- 单位
- School of Natural Sciences, Linnaeus University; Department of Chemistry, Wroclaw University of Environmental and Life Sciences
- 杂志
- Plant Cell Reports（2012）
- DOI
- 10.1007/s00299-012-1250-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物倍半萜合酶在大肠杆菌等微生物表达系统中容易形成包涵体，可溶性活性蛋白产量低，尤其ECS难以在细菌系统中有效表达。本研究旨在利用本氏烟草瞬时表达系统高效生产功能性植物倍半萜合酶（ADS和ECS），并对其酶学性质进行表征。
研究策略
将青蒿的ADS和ECS基因克隆到基于豇豆花叶病毒的pEAQ-HT载体（含Kozak序列和C端组氨酸标签），通过农杆菌LBA4404浸润本氏烟草叶片，并与携带番茄丛矮病毒P19沉默抑制因子的pJL3:p19共浸润，实现瞬时高表达，随后通过IMAC纯化并测定酶活。
研究路线图
核心内容
本研究利用本氏烟草瞬时表达系统，将青蒿中的紫穗槐二烯合酶（ADS）和表雪松醇合酶（ECS）基因克隆至基于豇豆花叶病毒的pEAQ-HT载体，并通过农杆菌浸润叶片，与P19沉默抑制因子共表达，实现了两种倍半萜合酶的高效功能性表达。经IMAC纯化后，ADS和ECS的重组蛋白产量分别达到90和96 mg/kg鲜重，显著高于大肠杆菌系统的10–20 mg/L。酶学表征显示，ADS的比活力为0.002 μmol min⁻¹ mg⁻¹，kcat为2.1×10⁻³ s⁻¹，主要产物为amorpha-4,11-diene（97%）；ECS的比活力为0.01 μmol min⁻¹ mg⁻¹，kcat为11×10⁻³ s⁻¹，主要产物为epi-cedrol（96%）。值得注意的是，植物来源的ADS仅产生1个副产物，而大肠杆菌来源的酶产生至少15个副产物，表明植物表达系统赋予更高的产物特异性。此外，该研究首次成功表征了ECS的动力学参数，弥补了其因细菌表达困难而缺失的数据。上述结果表明，本氏烟草瞬时表达系统是生产功能性植物倍半萜合酶的有效平台，尤其适用于微生物系统中难以表达的酶，为大规模酶生产和工业应用提供了可行方案。
创新点
['首次在本氏烟草瞬时表达系统中功能性表达并纯化青蒿ADS和ECS，产量分别达90和96 mg/kg鲜重，高于细菌表达系统（10-20 mg/L）', '植物来源的ADS比大肠杆菌来源的具有更高产物特异性，仅产生1个副产物（amorpha-4,7(11)-diene），而大肠杆菌产生至少15个副产物', '成功表征了ECS，弥补了其因细菌表达困难而缺失的动力学数据（kcat=11×10^-3 s^-1）']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜/青蒿素生物合成 | ADS | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 瞬时表达后经IMAC纯化，产量90 mg/kg FW，主要产物amorpha-4,11-diene占97% |
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜/青蒿素生物合成 | ECS | Epi-cedrol synthase | 催化 | 瞬时表达后经IMAC纯化，产量96 mg/kg FW，主要产物epi-cedrol占96% |
| Nicotiana benthamiana | 基因沉默抑制 | p19 (TBSV) | P19 | 调控 | 共浸润以便抑制转录后基因沉默(PTGS)，提高重组蛋白表达水平 |
关键发现
- ADS和ECS在9 dpi时转录水平最高，分别比15 dpi高约32倍和16倍；IMAC纯化获得重组蛋白产量ADS为90 mg/kg FW，ECS为96 mg/kg FW；纯化酶比活力ADS为0.002 μmol min^-1 mg^-1蛋白，ECS为0.01 μmol min^-1 mg^-1蛋白；kcat分别为2.1×10^-3 s^-1和11×10^-3 s^-1；产物分析表明ADS主要生成amorpha-4,11-diene（97%），ECS主要生成epi-cedrol（96%）；酶活测定产物产量为amorpha-4,11-diene
- 9 mg h^-1 kg^-1 FW，epi-cedrol
- 7 mg h^-1 kg^-1 FW。
研究结论
本氏烟草瞬时表达系统是生产功能性植物倍半萜合酶的有效平台，重组蛋白产量高且具有正确的产物特异性，特别适用于难以在微生物系统中表达的酶，可用于大规模生产及生物化学和工业应用。